miR-542-5p對1-磷酸鞘氨醇誘導的IEC-6細胞增殖的抑制作用*

蔣 萍， 穆攀偉， 李 靜， 蒙克嘎勒， 聶永梅， 谷曉艷， 吳桂霞△

(1新疆醫科大學基礎醫學院生理學教研室, 新疆 烏魯木齊 830011； 2中山大學附屬第三醫院內分泌科， 廣東 廣州 510630)

miR-542-5p對1-磷酸鞘氨醇誘導的IEC-6細胞增殖的抑制作用*

蔣 萍1， 穆攀偉2， 李 靜1， 蒙克嘎勒1， 聶永梅1， 谷曉艷1， 吳桂霞1△

(1新疆醫科大學基礎醫學院生理學教研室, 新疆 烏魯木齊 830011；2中山大學附屬第三醫院內分泌科， 廣東 廣州 510630)

目的： 觀察miR-542-5p對1-磷酸鞘氨醇(S1P)誘導的大鼠小腸隱窩上皮IEC-6細胞增殖的影響。方法: 建立穩定表達鞘氨醇激酶1(SphK1)的IEC-6細胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)，Western blot檢測SphK1蛋白表達，放射性同位素示蹤法測定SphK1酶活性和S1P分泌，細胞計數繪制生長曲線觀察細胞增殖，流式細胞術分析細胞周期變化，實時熒光定量PCR檢測miR-542-5p表達。結果: 與對照細胞相比，細胞系SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2中SphK1蛋白表達顯著升高，SphK1酶活性升高，細胞內外S1P濃度升高，細胞生長速度加快，細胞周期中S期細胞所占比例升高，miR-542-5p的表達量降低；在IEC-6細胞的培養液中加入S1P (0.5～10 μmol/L)，能顯著抑制miR-542-5p表達；采用siRNA干擾降低IEC-6細胞的SphK1，可明顯升高miR-542-5p表達。升高SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2細胞中miR-542-5p水平，則可降低S期細胞比例，抑制細胞增殖。結論: S1P通過降低IEC-6細胞中miR-542-5p水平，引起細胞周期由G1期向S期轉換，促進IEC-6細胞增殖。

miR-542-5p； 1-磷酸鞘氨醇； 鞘氨醇激酶1； IEC-6細胞； 細胞增殖

神經鞘脂類是一類廣泛存在于真核細胞膜上具有鞘氨基醇?；闹|，其代謝產物鞘氨醇(sphingosine，Sph)被鞘氨醇激酶(sphingosine kinase, SphK)磷酸化而生成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1- phosphate，S1P)。目前已經知道SphK有2個亞型：SphK1和SphK2。其中，SphK1/S1P信號通路是調節細胞生長、存活和凋亡的重要途徑之一[1-2]。SphK1過表達時，可以增加細胞內S1P的含量，促進細胞增殖[3-5]，是腫瘤細胞增殖和遷移的因素[6-7]。但是對其具體機制仍了解不多。

MicroRNA是由19～24個核苷酸組成的高度保守的非編碼RNA，參與細胞增殖、遷移和凋亡的調控[8]。miR-542-5p是新近發現的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤組織中檢測到其表達降低，并且這一抑制效應與腫瘤組織增生加劇、侵襲性升高等不良預后相關[9-12]。目前已經明確microRNA和SphK1/S1P信號通路中的SphK1存在互相調控關系：SphK1是microRNA的作用靶點[13-14]，microRNA的活性又受SphK1的調控[15]。這就提示SphK1/S1P信號通路有可能通過miR-542-5p來發揮作用，但對此還未見有相關報道。因此，本研究擬建立穩定表達SphK1的細胞系，增加S1P合成，來觀察miR-542-5p在S1P誘導的細胞增殖中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

大鼠小腸隱窩上皮細胞株IEC-6購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。DMEM培養基、胰蛋白酶和胎牛血清購自HyClone。限制性內切酶NotⅠ和T4 DNA連接酶購自寶生物工程有限公司。Opti-MEM培養基和Lipofectamine 2000購自Invitrogen。RNeasy Mini Kit、miScriptⅡRT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、miR-542-5p、U6引物、mimic-miR-542-5p及陰性對照(scramble)購自QIAGEN。細胞周期檢測試劑盒購自貝博生物。c-Myc和GAPDH抗體購自Santa Cruz。SphK1抗體購自Cell Signaling Technology。蛋白定量試劑盒和RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司。SphK1 (NM_021972) cDNA Clone in pCMV6-AC 購自OriGene。陰性對照C-siRNA(5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCA-3’)及siSphK1(5’-AUCCUUUAAACUGAUGCUCACCG-3’)購自Invitrogen。其它試劑均為國產分析純。

2 主要方法

2.1 細胞培養 棄去培養液，PBS洗滌3次，加入0.05%的胰蛋白酶37 ℃消化細胞，倒置顯微鏡下觀察，待細胞收縮變圓，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液終止反應，1 500 r/min離心5min，棄去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養液重懸細胞，1∶3的比例傳代，實驗用4～6代細胞。

2.2 SphK1重組質粒構建 使用限制性內切酶NotI從pCMV6-AC-SphK1質粒切下SphK1 cDNA，克隆入pCMV6-Neo質粒NotI位點，PCR篩選后用SacI和BamH I雙酶切鑒定克隆方向，經雙向測序鑒定讀框無誤后，提取重組質粒，重組質粒結構見圖1。SphK1上游引物為5’-TGAACCTGCTGTCTCTGC- AC-3’，下游引物為5’-CAGGTGTCTTGGAACCCACT-3’。PCR條件： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 45 s， 52 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s，共35個循環； 72 ℃ 10 min。引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

Figure 1.The SphK1 was cloned into an expression vector pCMV6-Neo.

圖1 SphK1 cDNA在表達載體pCMV6-Neo中嵌入的模式圖

2.3 穩定轉染細胞系的建立 轉染前1 d，將生長狀態良好的IEC-6細胞用胰酶消化，接種于60 mm培養皿，37 ℃、5% CO2恒溫培養12～16 h，細胞密度達70%～90%時，按照LipofectamineTM2000使用手冊的指示，將pCMV6-Neo-SphK1轉染至IEC-6細胞內，按照同樣的程序轉染pCMV6-Neo空載體(vector)作為空載體對照；再用非篩選性培養基培養48 h后，以600 mg/L的G418選擇培養基進行篩選，適時挑選抗性克隆，24孔板、6孔板和25 mL培養瓶逐級擴大培養，獲得穩定表達SphK1蛋白的細胞系。Western blot檢測SphK1的表達，最終挑出2個穩定表達SphK1的細胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)及vector細胞系用于實驗。

2.4 S1P分泌量及SphK1酶活性分析 據文獻[16]的描述，采用放射性同位素示蹤法檢測SphK1細胞系S1P合成以及SphK1酶活性。簡單描述如下： 1.5 μmol/L 0.45 μCi D-erythro-[3-3H]鞘氨醇37 ℃孵育10 min用以標記細胞內鞘氨醇，之后用堿性苯酚-甲醇提取培養液及細胞內的S1P。用每mg蛋白釋放多少pmol的S1P為單位計算細胞內外S1P的量，SphK1的酶活性以單位時間S1P的釋放量為單位。

2.5 細胞生長曲線的記錄 將SphK1-IEC-C1、SphK1-IEC-C2及vector細胞以每孔1.5×104接種于12孔板，每個樣本做4個復孔，每天以細胞計數板計算每孔細胞數，直至細胞融合，繪制細胞生長曲線。

2.6 Mimic-miR-542-5p的瞬時轉染 將處于對數生長期的SphK1-IEC-C1、SphK1-IEC-C2及vector的細胞接種于60 mm培養皿，根據Lipofectamine 2000轉染說明書配制轉染液：無血清、無雙抗的Opti-MEM培養液中混合適量mimic-miR-542-5p和Lipofectamine 2000，室溫放置20 min，每孔轉染50 nmoL/L的mimic-miR-542- 5p，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育6 h后，更換普通培養基，48 h后進行細胞周期分布分析。同時設立隨機序列陰性對照組(scramble組)。

2.7 Western blot法檢測蛋白表達 RIPA裂解液冰上裂解細胞，收集提取液，勻漿后4 ℃ 14 000 r/min離心10 min，取上清液，按蛋白定量試劑盒操作說明測定蛋白濃度。蛋白濃度測定后，進行SDS-PAGE，上樣量為30 μg，電印跡轉移法將凝膠內的蛋白質轉至硝酸纖維素膜上，用含5%牛血清白蛋白組分的TBST溶液室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗脫3次，每次10 min，再與Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 溶液洗脫3次，每次10 min，之后與ECL試劑反應2 min，使用ProteinSimple公司的Flour Chem E型凝膠成像系統曝光、成像，以ImageJ圖像處理軟件測定感光區帶的感光密度。

2.8 細胞周期分布檢測 收集細胞，根據細胞周期檢測試劑盒說明書所述步驟對DNA進行染色。簡述如下：冰PBS沖洗細胞2次，75%乙醇-20 ℃固定1 h，冰PBS沖洗1次，400 μL PBS重懸細胞，加入20 μL溶液A，37 ℃孵育30 min，碘化丙啶(propidium iodide，PI)于4 ℃避光染色1 h后，LSRⅡ流式細胞儀(BD)檢測細胞周期分布，每樣本獲得60 000細胞，Modfit軟件分析細胞周期各時期的百分率。

2.9 RT-qPCR 按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，利用紫外線分光光度計檢測RNA濃度與純度，反轉錄合成cDNA，定量PCR儀(Applied Biosystems 7500)平臺進行定量分析，以U6 snRNA為內參照，miR-542-5p的相對表達量采用2-ΔΔCt計算。每個樣本重復3次。

2.10 RNA干擾 進行RNA干擾前1 d，1×105細胞接種于60 mm培養皿。根據Lipofectamine 2000轉染說明書配制轉染液：無血清、無雙抗的Opti-MEM培養液中混合適量siSphK1和Lipofectamine 2000，室溫放置20 min，每個培養皿轉染20 mmol/L的siSphK1，置于37 ℃、含5%CO2的培養箱中孵育6 h后，更換普通培養基，48 h后收取細胞，提取RNA及蛋白質。同時設立未轉染的空白對照組和隨機序列陰性對照組(C-siRNA組)。每個樣本重復3次。

3 統計學處理

計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 17.0統計軟件分析，均數比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 穩定表達SphK1的細胞系中SphK1酶活性及S1P生成的改變

與vector細胞相比，穩定表達SphK1的細胞(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)，SphK1的表達升高約2倍，SphK1的活性增高1.8～2.1倍，細胞內及細胞外S1P的濃度升高(P<0.01)，SphK1/S1P信號通路處于激活狀態，見圖2、3。

Figure 2.SphK1 protein expression in control vector and stable SphK1-expressing cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector cells.

圖2 穩定表達SphK1的細胞系SphK1蛋白表達的測定

2 SphK1/S1P升高對細胞增殖的影響

與vector細胞相比，穩定表達SphK1的細胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)生長速度加快，更早到達細胞融合階段，見圖4。與vector細胞相比，穩定表達SphK1的細胞系G1期細胞比例明顯減少，S期細胞所占的比例升高，見圖5。

Figure 3.SphK1 activity (A) and S1P secretion (B) in control vector and stable SphK1-expressing cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector cells.

圖3 穩定表達SphK1細胞系SphK1酶活性以及S1P含量的測定

Figure 4.Cell growth curve assay of control vector and stable SphK1-expressing cells cultured for 15 d. Total cell number was counted daily until the cells reached confluence. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector cells.

圖4 穩定表達SphK1細胞系的細胞生長曲線的繪制

3 SphK1/S1P對miR-542-5p表達水平的影響

與vector細胞相比，穩定表達SphK1的細胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)miR-542-5p表達下降(P<0.05)。在IEC-6細胞培養液中直接加入S1P (0.5～10 μmol/L)，共同孵育4 h，miR-542-5p的表達降低，其中S1P在2.5 μmol/L時的抑制率最高(P<0.05)，見圖6。

Figure 5.Cell cycle analysis of control vector and stable SphK1-expressing cells were determined by flow cytometry 36 h after cells were cultured.

圖5 穩定表達SphK1的細胞系細胞周期分布情況

Figure 6.The levels of miR-542-5p in control vector and stable SphK1-expressing cells (A) and the levels of miR-542-5p in IEC-6 cells treated with S1P (0.5～10 μmol/L) for 4 h (B) were examined by RT-qPCR analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector cells；#P<0.05vs0 μmol/L.

圖6 穩定表達SphK1的細胞系中miR-542-5p表達的測定以及IEC-6細胞培養液加入S1P對miR-542-5p表達的影響

4 RNA干擾抑制IEC-6細胞SphK1表達對miR-542-5p水平的影響

與空白對照及C-siRNA細胞相比，IEC-6細胞轉染siSphK1 48 h后，SphK1蛋白表達下降約80%，miR-542-5p的表達顯著升高(P<0.05)，見圖7。

5 在穩定表達SphK1細胞系轉染mimic-miR-542-5p對細胞周期分布的影響

在穩定表達SphK1的細胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)轉染mimic-miR-542-5p，升高細胞內miR-542-5p的表達。與轉染陰性對照scramble的細胞相比，轉染mimic-miR-542-5p的SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2細胞中，S期細胞的所占比例下降，見圖8；在轉染后的第3天和第5天細胞數量降低(P<0.01)，見圖9。

Figure 7.The expression of SphK1 (A) and miR-542-5p (B) in IEC-6 cells transfected with C-siRNA or siSphK1 Mean±SD.n=3.*P<0.05vsC-siRNA cells.

圖7 siRNA抑制IEC-6細胞SphK1蛋白表達對miR-542-5p表達的影響

討 論

鞘磷脂的代謝產物包括神經酰胺(ceramide，Cer)、Sph和S1P，Cer和Sph是細胞增殖的負調控因子，抑制細胞生長，誘導細胞凋亡；S1P則刺激細胞生長，抑制細胞凋亡[2]。細胞內的Cer、Sph和S1P可以發生相互轉化，并通過酶促反應維持其動態平衡。本研究在IEC-6細胞建立穩定表達SphK1的細胞系，升高SphK1酶活性，打破酶促反應的平衡，促進細胞內S1P的生成和細胞外S1P的分泌，用以探討SphK1/S1P系統促進細胞增殖的機制。

MicroRNA在細胞的增殖、分化、凋亡等方面都具有重要的調節作用，研究已證實SphK1是micro-RNA的作用靶點[13-14]，microRNA的活性也受SphK1的調控[15]。miR-542-5p是新發現的腫瘤抑制因子，能抑制神經母細胞瘤的增殖[17]。本研究中穩定表達SphK1的2個細胞系(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)，細胞增殖速度加快的同時miR-542-5p表達降低，相反，通過RNA干擾抑制IEC-6細胞SphK1蛋白的表達，則miR-542-5p的表達升高。這提示SphK1催化而生成的產物S1P可能是通過抑制miR-542-5p的表達，促進細胞增殖。目前已經知道S1P可以通過2種方式產生促細胞增殖的效應，一是分泌至細胞外，與細胞膜上的G蛋白偶聯受體S1PR結合發揮效應[3, 18]，另一種是直接在細胞內發揮第二信使的作用，觸發Ca2+動員[19-20]。本研究中直接在IEC-6細胞的培養液中加入S1P，也能降低miR-542-5p表達，提示S1P能通過細胞外途徑抑制miR-542-5p的表達。

Figure 8.Effects of mimic-miR-542-5p on the cell cycle of stable SphK1-expressing cells (SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2) determined by flow cytometry.

圖8 在SphK1-IEC-C1和 SphK1-IEC-C2細胞分別轉染mimic-miR-542-5p對細胞周期分布的影響

目前已經知道SphK1/S1P信號通路能對細胞周期產生影響。Kohno等[19]在大鼠腸上皮細胞轉染腺病毒載體升高SphK1的表達，S期細胞所占比例升高；反之，使用N，N-二甲基鞘氨醇抑制SphK1表達，S期細胞所占比例下降；敲除了SphK1的ApcMin/+SphK1-/-小鼠腸息肉組織中細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4， CDK4)蛋白表達降低。Kalhori等[21]使用FTY720抑制甲狀腺癌細胞S1P1受體表達，細胞增殖速度減慢，停留在G1期的細胞比例增多，CDK的抑制因子p2l和p27蛋白表達升高。上述研究提示，SphK1/S1P系統促細胞增殖效應與調控細胞周期有關。本研究中，高表達SphK1的細胞，miR-542-5p表達降低，S期細胞所占比例升高，細胞生長加快。反之，在穩定表達SphK1的細胞(SphK1-IEC-C1和SphK1-IEC-C2)轉染mi-mic-miR-542-5p，升高miR-542-5p表達，則表現為停留在G1期的細胞增多，細胞生長速度減慢，提示miR-542-5p能通過調控IEC-6細胞的細胞周期，調節細胞生長。

Figure 9.The numbers of stable SphK1-expressing cells (SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2) transfected with scramble or mimic-miR-542-5p. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖9 在SphK1-IEC-C1和 SphK1-IEC-C2細胞分別轉染mimic-miR-542-5p對細胞數量的影響

綜上所述，本研究的結果顯示在IEC-6細胞上穩定表達SphK1，能促進S1P合成與分泌，后者通過抑制miR-542-5p的表達，促進細胞周期由G1期向S期轉換，促進細胞增殖。CDK4等細胞周期調控因子可能是miR-542-5p的靶基因和靶蛋白，其具體機制如何在今后研究工作中進一步探索。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

miR-542-5p down-regulates IEC-6 cell proliferation induced by sphingosine-1-phosphate

JIANG Ping1, MU Pan-wei2, LI Jing1, Mengkegale1, NIE Yong-mei1, GU Xiao-yan1， WU Gui-xia1

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofEndocrinology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:wuguixia_good@163.com)

AIM: To observe the effects of miR-542-5p on the proliferation of rat small intestine crypt epithe-lial IEC-6 cells induced by sphingosine-1-phosphate (S1P). METHODS: Two IEC-6 cell lines (SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2) were established, which expressed sphingosine kinase-1 (SphK1) stably. Radioactive tracer was used to detect SphK1 activity and S1P secretion. The cell proliferation was observed by cell counting and described by drawing growth curve, and the cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. The level of miR-542-5p was evaluated by RT-qPCR. RESULTS: Compared with control vector cells without SphK1 cDNA, both SphK1-IEC-C1 and SphK1-IEC-C2 cell lines showed that Sphk1 was elevated, both intracellular and extracellular S1P increased dramatically, the rate of cell growth was faster, the percentage of the cells in S phase increased, and miR-542-5p expression decreased. S1P (0.5～10 μmol/L) led to the decrease in miR-542-5p expression. On the contrary,SphK1 silencing resulted in the increase in miR-542-5p expression in the IEC-6 cells. The miR-542-5p was elevated in SphK1-IEC-C1 cells and SphK1-IEC-C2 cells, which caused the decrease in the percentage of the cells in S phase. The cell growth rate in the above-mentioned 2 cell lines decreased compared with negative control group. CONCLUSION: In IEC-6 cells, S1P promotes proliferation by inhibiting miR-542-5p expression， which induces the cell cycle transferring from G1phase to S phase.

miR-542-5p; Sphingosine-1-phosphate; Sphingosine kinase-1; IEC-6 cells; Cell proliferation

1000- 4718(2017)07- 1184- 07

2016- 11- 02

2017- 01- 06

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(No. 2013211A072)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.005

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0991-4362449; E-mail: wuguixia_good@163.com