XCT-790對沉默DKK1、Sost腺病毒載體轉染MG63細胞中OPG、CTGF、FGF2、TNFα的影響研究

李釗政 萬雷 喬榮勤 彭鵬豪 肖本浩 劉少津

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院骨科，廣東 廣州 510240

骨質疏松癥是困擾老年人身體健康的一大疾病，亦是世界性前沿研究難題。Wnt信號通路是與骨代謝相關的一個重要胞內信號傳導通路，DKK1和Sost是Wnt信號通路的負調控因子，在骨形成過程中起重要作用，被視為骨相關疾病如骨質疏松、骨修復的治療靶點[1]。近年來，有研究表明雌激素受體相關受體α(estrogen receptor-related receptor alpha，ERRα)與骨代謝的調節密切相關[2]。Auld 等[3]發現，ERRα通過抑制Wnt信號靶基因表達來調控成骨細胞分化，當成骨細胞中ERRα基因沉默后，可促進Wnt通路轉導。而XCT-790是ERRα的特異性抑制劑[4]，可以顯著降低成骨細胞的增殖能力和礦化能力[5]。本實驗采用沉默DKK1、Sost腺病毒載體轉染MG63細胞，并用ERRα抑制劑(XCT-790)干預轉染的MG63細胞，應用Western blot檢測MG63細胞中骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、成纖維生長因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)蛋白的表達量，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人成骨肉瘤細胞(MG63) 由中國科學院上海細胞所細胞庫提供，DMEM培養基、胎牛血清、Pen/Strep和Opti-MEM培養基均購自美國Gibco公司；ERRα抑制劑(XCT-790)購自于Sigma公司；逆轉錄試劑盒、Lipofectamine 2000，TRIzol Reagent、Taq DNA聚合酶、熒光定量PCR試劑盒均購自美國Invitrogen 公司；質粒提取試劑盒、膠回收/純化試劑盒購自北京天根生物有限公司；DH5α感受態細胞購自北京鼎國生物有限公司；BJ5183感受態細胞購自上海杰美基因公司；T4DNA連接酶、KpnⅠ、XhoⅠ、PmeⅠ、PacⅠ限制性內切酶購自美國NEB公司；抗Wnt信號通路抑制因子DKK1抗體購自美國CST公司；抗骨硬化蛋白(Sost) 抗體購自美國Abcam公司；抗結締組織生長因子(CTGF)抗體、抗堿性成纖維細胞生長因子(FGF2)抗體購自美國Santa公司；抗人成骨細胞內骨保護素(OPG)抗體、抗腫瘤壞死因子α(TNFα)抗體購自美國abcam公司；蛋白Marker購自美國Fermentasa 公司；蛋白酶抑制劑/磷酸化抑制劑、ECL發光液購自德國Merck公司；RIPA 細胞裂解液、Triton 100、EGTA、MTT 購自美國Sigma 公司；Calcium OtangeTM Indicators 購自美國Molcular Probes公司。細胞培養箱(DHP-9052，中國上海一恒)、超凈工作臺(SWCJ-1FD，中國江蘇蘇凈)、高速低溫離心機(H1650-W/H1650W，中國湘儀)、普通PCR儀(TC-S，中國博日)、熒光定量PCR儀(ABI7500，美國Thermo)、倒置熒光顯微鏡(IX73，美國OLYMPUS)。電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra，美國Bio-Rad)、蛋白轉印儀(Mini Trans-Blot，美國Bio-Rad)、凝膠成像系統(ChemiDoc MP，美國Bio-Rad)，微量核酸定量儀(Nanodrop-2000，美國Thermo)。

1.2 方法

1.2.1MG63細胞培養：收集對數期MG63細胞，制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×105cells/mL。6孔板中每孔加入2 mL細胞懸液，置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養。培養24 h后，用沉默重組腺病毒顆粒轉染MG63細胞(MOI=50)。

1.2.2目的基因沉默重組腺病毒載體的構建[6]：在NCBI數據庫查詢參考核苷酸序列DKK1(801bp)、Sost(642bp)，采用Primer 5.0設計PCR引物，設計出特異性針對DKK1、Sost 的序列和無關對照序列(Scr)，并在兩端分別加入AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位點。將連接產物轉化到感受態的DH5α細胞，用質粒小提試劑盒提取轉化到DH5α細胞重組質粒，對提取的重組質粒進行測序鑒定，提取測序正確的腺病毒，經培養提取無內毒素質粒，再經過篩選及病毒包裝，成功構建沉默DKK1、Sost腺病毒載體。

1.2.3XCT-790處理沉默DKK1、Sost腺病毒載體轉染的MG63細胞：100 μM XCT-790溶于838 μL DMSO中配制成儲存液。臨用時，以XCT-790儲存液：含10%FBS DMEM高糖培養基=1∶1 000的比例稀釋XCT-790，即配制成含100 μM XCT-790的DMEM高糖培養基(DMSO終濃度為0.1%)，分別處理空載腺病毒組和DKK1、Sost沉默腺病毒載體轉染組，培養24 h。

1.2.4細胞總蛋白的提取及濃度測定：消化收集細胞，1000 rpm離心5 min，盡可能棄盡上清。預冷PBS洗滌細胞沉淀兩次，向細胞沉淀中加入20 μL RIPA(含有0.2 μL PMSF)裂解液，置于冰上裂解細胞30 min，期間用槍頭吹打使細胞充分裂解。在4 ℃，12 000 rpm離心30 min，小心轉移上清到新的預冷的EP管中，-20 ℃保存備用。900 μL Bradford加入1 μL待測蛋白和99 μL 0.9%生理鹽水，混勻后在595 nm處檢測吸光度，根據標準品做出的標準曲線上計算出各樣本蛋白濃度。

1.2.5OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的檢測：MG63細胞轉染重組腺病毒48 h后，分為空白對照組、沉默DKK1組、沉默Sost組、沉默DKK1、Sost組、XCT-790處理空載腺病毒組、XCT-790處理沉默DKK1組、XCT-790處理沉默Sost組、XCT-790處理沉默DKK1、Sost組8組，棄舊培養基，消化收集細胞，提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉膜、免疫反應，化學發光顯色后進行圖像分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組的MG63細胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)蛋白灰度分析(圖1)

圖1 各組MG63細胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)灰度分析情況(凝膠電泳法)Fig.1 Analysis of gray area of OPG, CTGF, FGF2, and TNFα in each MG63 cell group (The gel electrophoresis)注：1：空白對照組，2：沉默DKK1組，3：沉默Sost組，4：沉默(DKK1+Sost)組，5：XCT-790處理空載腺病毒組，6：XCT-790處理沉默DKK1組，7：XCT-790處理沉默Sost組，8：XCT-790處理沉默(DKK1+Sost)組。

2.2 各組MG63細胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)蛋白表達情況(表1)

表1 各組MG63細胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)蛋白表達情況Table 1 Expression of OPG, CTGF, FGF2, TNFα in each MG63 cell group

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與沉默DKK1組比較，#P<0.05；與沉默Sost組比較，△P<0.05；與沉默(DKK1+Sost)組比較，▲P<0.05。

圖1、表1結果顯示：(1)與空白對照組對比，沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost可以提高OPG、CTGF、FGF2表達量(P<0.05)，降低TNFα表達量，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)；XCT-790干預MG63細胞可降低OPG、CTGF、FGF2表達量(P<0.05)，增加TNFα表達量，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。(2)與沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost組相比較，XCT-790處理沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost組可降低因沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost而增加的OPG、CTGF、FGF2表達量，增加因沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost而降低的TNFα表達量，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

近年來，國內外不少研究表明Wnt/β-catenin信號通路在骨代謝過程中具有重要意義，是研究骨質疏松癥治療的新熱點。其組成主要包括細胞外因子(Wnt)、跨膜受體(frizzled)、胞質蛋白(β-catenin)及核內轉錄因子等一系列蛋白。Wnt信號刺激成骨細胞增殖，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，促進轉錄因子Osterix1(Osx1)向成骨細胞表達[7]。DKK1和Sost蛋白為Wnt信號通路的細胞外拮抗劑，與骨形成的調控密切相關。DKK1直接與低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein re-ceptor related protein，LRP)受體結合，或者與其跨膜受體Kremen(Kremen-1、Kremen-2) 結合后再與LRP5/6結合形成三聚體，誘導快速的細胞內吞，減少細胞膜上的LRP5/6，由此阻斷了Wnt信號向胞內的傳遞，使骨形成減少[8]。Sost 能競爭性結合Wnt信號通路中的共受體LRP5來抑制該信號通路，從而引起骨形成障礙[9]。雌激素受體相關受體α(ERRα)是最早發現的一種孤兒核受體，是核受體超家族中的一員。有研究表明，ERRα表達于成骨細胞分化的所有階段，用反義寡核苷酸阻斷ERRα降低了大鼠RC細胞增殖期的細胞數目，之后又抑制了骨結節形成[10]。然而，Delhon 等[11]發現，ERRα敲除小鼠股骨松質骨骨體積和密度增加，體外培養成骨細胞和骨髓間充質干細胞沉默ERRα后發現細胞增殖與骨向分化能力增強。OPG屬分泌型糖蛋白，是一種可溶性腫瘤壞死因子受體，在體內以單體和同源二聚體兩種形式存在。其主要功能是抑制破骨細胞的分化，抑制成熟破骨細胞的骨吸收活性并誘導其凋亡。在體外，1～40 ng/mL(ED50=4～6 ng)的OPG可抑制破骨細胞生成，在超過11 d的細胞培養時間中，有效作用時間范圍是第5～11 d[12]。CTGF是一種新發現可刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積生長因子，亦是高度保守CCN(CTGF、Cef10/cyr61和Nov縮寫)多肽家族中成員。有研究表明，CTGF可抑制成骨細胞核因子Kappa B配體受體(RANKL)的表達，提示CTGF可通過抑制成骨細胞RANKL的表達，可能具有間接抑制成熟破骨細胞活化的作用[13]。FGF2是膜內成骨和軟骨化成骨的主要調節因子，在成骨細胞中，FGF2激活多種信號通路包括胞外信號調節激酶(ERK)途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑，進而影響成骨細胞的轉錄，被認為是成骨樣細胞的靶基因[14]。TNFα是17kDa的細胞因子，可由破骨細胞樣細胞及成骨細胞合成，是十分重要的破骨細胞激活因子，亦是一種強有力的骨吸收誘導劑，可使破骨細胞活性增強。有報道表明，基質內所含的破骨和成骨類細胞以及髓腔間充質類細胞均可以通過自分泌或者旁分泌方式獲得細胞因子，并參與機體骨代謝調節[15-16]。由此可知，OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的表達量與成骨細胞的增殖分化關系密切。

本實驗研究中采用沉默DKK1、Sost腺病毒載體轉染MG63細胞，并使用XCT-790干預，進一步研究不同組別MG63細胞中OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白在不同干預情況下的表達量。實驗結果表明，沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost可以提高在MG63細胞中OPG、CTGF、FGF2蛋白的表達量，降低TNFα蛋白的表達量，尤以DKK1、Sost二者同時沉默時影響最大，其作用機制可能是DKK1、Sost沉默后，Wnt信號通路被激活，刺激成骨細胞MG63增殖活化，促進成骨細胞形成，引起OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的變化。而使用XCT-790干預后， XCT-790可通過抑制ERRα的表達和競爭Wnt信號通路的靶基因，從而降低Wnt信號通路的活性，影響成骨細胞MG63的形成和增殖，引起OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的變化，這與楊冰等[5]的研究結果一致。 本實驗結果支持ERRα促進成骨細胞分化與增殖，其抑制劑XCT-790能降低成骨細胞活性的假說。而ERRα與Wnt信號通路之間是競爭拮抗關系，抑或是協同關系，本實驗結果證實二者有協同作用。Delhon 等[11]認為ERRα抑制成骨細胞分化與增殖，楊冰等[5]研究表明ERRα促進成骨細胞分化與增殖，ERRα在成骨細胞中的研究結果不一致的原因可能有3個方面：①動物成骨細胞與人成骨細胞非同一種屬，故而實驗結果存在分歧，本實驗為人成骨細胞實驗；②ERRα抑制劑XCT-790干預的時間不一致；③實驗條件和環境等方面不一致。

此外，本實驗中XCT-790是通過影響Wnt/β-catenin信號通路還是獨立發揮作用，ERRα與Wnt/β-catenin信號通路之間的具體聯系如何，仍需要進一步的研究和探討。