雙柏膏微生物限度檢查方法適用性試驗

鐘柳芳 肖文可 孫樹周 溫穎婉

·實驗研究·

雙柏膏微生物限度檢查方法適用性試驗

鐘柳芳 肖文可 孫樹周 溫穎婉

目的建立雙柏膏的微生物限度檢查方法, 并進行適用性實驗。方法按照中國藥典(2015年)對雙柏膏進行微生物限度檢查適用性試驗。雙柏膏可溶于十四烷酸異丙酯, 溶解后薄膜過濾,并在水相沖洗液中加入乳化劑聚山梨酯80, 控制菌檢查采用薄膜法。結果需氧菌總數計數、真菌和酵母菌總數計數適用性實驗中的回收率比值均在 0.5～2 內, 控制菌生長良好, 符合《中國藥典》2015年版規定。結論該方法有效可行, 可用于雙柏膏的微生物限度檢查。

雙柏膏；微生物限度；適用性試驗；薄膜過濾

雙柏膏是廣州市番禺區中醫院制劑, 處方來源于85年版醫院制劑規范中的雙柏膏。處方主要成分為黃柏、側柏葉、冰片、凡士林組成的一種外用中藥復方膏劑, 具有清熱、消炎、祛瘀、止痛的功效［1-3］。臨床上用于跌打損傷、瘡痛腫毒、消炎等癥, 是現代骨傷科中藥治療的主要藥物。為了提高雙柏膏質量標準, 更準確地反映該制劑質量真實狀況, 確保醫院制劑的用藥安全, 本文根據《中國藥典》2015年版四部［3］微生物限度檢查法中的相關規定, 雙柏膏微生物限度檢查法進行了重新修訂并進行了適用性試驗。在適用性試驗過程中,發現該制劑處方中黃柏［1］、側柏葉［2］、冰片［3］對微生物限度檢查造成嚴重干擾, 常規平皿法、稀釋法檢查需氧菌總數計數真菌和酵母菌總數計數適用性實驗中的回收率比值均不在 0.5～2 內。利用雙柏膏可溶于十四烷酸異丙酯后, 置于在含有0.5%的吐溫80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 ml分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液, 用薄膜過濾法可以有效地去除抑菌成分, 達到滿意的效果, 現對研究作如下匯報分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器 全自動電熱壓力蒸汽滅菌器(型號：YM30Z, 上海三申醫療設備公司);霉菌培養箱(型號：LRH-150, 上海一恒科學儀器有限公司);生化培養箱(型號：SPX-150B, 上海悅豐儀器表有限公司)；電熱恒溫水浴箱WBK-4A, 廣東環凱微生物科技有限公司)；無菌檢查儀(型號：WJ-6, 天津市羅根科技有限公司)；快速混合儀(型號：SZ-1, 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；生物安全柜(型號：BHC-1300ⅡA2,蘇凈集團蘇冊安泰空氣技術有限公司)。

1.2 供試藥品 雙柏膏(批號：20160911、201601007、20161116,廣州市番禺區中醫院制劑室)。

1.3 培養基 胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號:20160816)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(批號31105120)、胰酪大豆胨液體培養基(TSB)(批號:3104880)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(批號:3102307)、pH=7.0無菌氯化鈉蛋白凍緩沖液(3104875)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基(批號：3104874), 以上培養基均由廣東環凱微生物科技有限公司生產, 均按照《中國藥典》2015版第四部通則有關規定配制并驗證。

1.4 菌株 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌均由中國醫學細菌保藏中心提供, 黑曲霉由中國藥品生物制品檢定所提供, 用于菌液制備的工作菌株均為第3代。

1.5 方法

1.5.1 菌液的制備 按照中國藥典 2015 年版要求, 將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌分別接種于新鮮培養物, 然后至胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)中, 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的TSB于33℃環境中培養 18 h；枯草芽孢桿菌的TSB在33℃環境中培養 24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中, 23℃環境中培養48 h(菌液a)。用 0.9%無菌氯化鈉溶液將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養物制成每1 ml含菌數≤100 cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物培養 120 h, 用 5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液(含 0.05%聚山梨酯 80)將孢子洗脫, 再用無菌毛細吸管吸出孢子懸液至無菌試管內, 用含 0.05%聚山梨酯 80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成孢子懸液(每 1 ml含孢子數≤100 cfu)。

1.5.2 供試液制備

1.5.2.1 供試液的制備 取10 g雙柏膏可溶于20 m l十四烷酸異丙酯后, 置于在含有0.5%的吐溫80的p H=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 m l分液漏斗中充分振搖、萃取,靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液(供試液a)。

1.5.2.2 試驗組 取供試液a 1 m l, 加入 100 m l p H =7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液中, 同時加入1 m l菌液a, 搖勻后薄膜過濾, 每膜用上述緩沖液600 m l 分次沖洗過濾, 取出濾膜貼至相應的瓊脂平皿, 按中國藥典2015 年版規定培養。真菌和酵母菌總數計數為白色念珠菌和黑曲霉, 培養基為沙氏葡萄糖瓊脂培養基?？倲涤嫈档男柩蹙鸀榻瘘S色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉, 培養基為T S B, 每種試驗菌株的試驗組過濾、培養2 次。

1.5.2.3 供試品對照組 取供試液a 1 m l, 不加菌液, 根據試驗組方法計數菌數。每種試驗菌株的供試品對照組同法操作 2 次。

1.5.2.4 菌液對照組 用p H=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液, 在100 m l稀釋液中加入1 m l試驗菌液, 根據試驗組方法測定菌數。計數方法適用性試驗回收率計算公式：試驗組菌回收率比值=試驗組菌落數供試品對照組菌落數)/菌液對照組菌落數。

1.5.3 控制菌檢查方法適用性試驗 取10 g雙柏膏可溶于20 ml十四烷酸異丙酯后, 置于在含有0.5%的吐溫80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 ml分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液(供試液a)。

1.5.3.1 金黃色葡萄球菌檢查適用性試驗結果 取兩份10 ml供試液a薄膜過濾, 用pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至600 ml, 分3次沖洗, 200 ml/次, 在最后一次沖洗液中分別加入銅綠假單胞菌、含菌50～100 cfu的金黃色葡萄球菌懸液1 ml, 過濾, 取出濾膜, 接種100 ml TSB中, 30～35℃環境中培養24 h, 取培養物分別劃線接種于溴化十六烷基三甲銨(CTMAB)瓊脂培養基和甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板,培養18～72 h, 每種菌平行制備2張濾膜。

1.5.3.2 陰性對照組 以稀釋劑代替供試液, 不加試驗菌,照“1.5.2.2”項中的步驟進行操作。

2 結果

2.1 需氧菌總數計數、真菌和酵母菌總數計數適用性試驗結果 試驗組菌回收率均在《中國藥典》(2015年)中規定的 0.5～2 cfu/皿, 說明薄膜過濾法應用于本品具有可行性。見表1, 表2。

表1 需氧菌總數計數適用性試驗結果

表2 真菌和酵母菌總數計數適用性試驗結果

2.2 銅綠假單胞菌控制菌及金黃色葡萄球菌控制菌適用性試驗結果 兩種菌的適用性試驗中試驗組均為陽性, 對照組均為陰性, 說明此法應用于本品微生物限度控制菌檢查具有可行性。見表3, 表4。

表3 銅綠假單胞菌控制菌適用性試驗結果

表4 金黃色葡萄球菌控制菌適用性試驗結果

3 討論

雙柏膏是《中醫傷科學講義》中的經典處方, 常規檢查法［4］會對檢查造成干擾。為降低抑菌成分, 消除干擾, 本次研究中采用薄膜過濾法進行檢查, 試驗中將樣品直接溶于無菌十四烷酸異丙酯, 用勻漿儀混勻, 取下清液膜過濾的方法進行實驗, 為確保過濾效果良好, 采用含有0.5%乳化劑聚山梨酯 80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液至100 ml分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置, 取下層液作為(1∶10)供試液, 用薄膜過濾法可以有效地去除抑菌成分, 能輕松通過微孔膜過濾, 避免濾膜堵塞。在實驗過程中使用微生物限度儀沖洗900 ml, 分析金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗組回收比值產生的原因可能與沖洗時微生物限度儀底座一直固定, 導致藥物無法充分洗脫有關。在沖洗的過程中, 集菌儀邊沖洗邊振搖則沖洗至900 ml各菌株的回收比值則可達到要求。通過表1、表2可以看出, 試驗組菌回收率均在《中國藥典》(2015年)中規定的 0.5～2 cfu/皿, 說明薄膜過濾法應用于本品具有可行性。此外, 兩種控制菌的適用性試驗中試驗組均為陽性, 對照組均為陰性, 說明此法應用于本品微生物限度控制菌檢查具有可行性。結合工作經驗認為試驗中的供試液制備較為繁瑣復雜, 尤其是非水溶性又具抗菌作用的軟膏制劑, 因而建議最好選用能溶解基質的有機溶劑(無菌十四烷酸異丙酯)必要時可加熱45℃以下的加入含有0.1%～1%乳化劑聚山梨酯 80的pH=7.0無菌蛋白胨-氯化鈉緩沖液100 ml置于分液漏斗中充分振搖、萃取, 靜置取下層液作為(1:10)供試液, 這樣可直接用薄膜過濾法進行微生物限度檢查方法, 并能通過適用性試驗, 本方法驗證結果準確、可靠、重現性好。

［1］ 吳嘉瑞, 張冰, 張光敏.黃柏藥理作用研究進展.亞太傳統醫藥, 2009, 5(11):160-162.

［2］ 張俊飛, 孫廣璐, 張彬, 等.側柏葉藥理作用的研究進展.時珍國醫國藥, 2013, 24(9):2231-2233.

［3］ 姜建昌, 曹雷, 姚瑜潔, 等.冰片的臨床應用研究概況.現代中西醫結合雜志, 2013, 22(2):221-223.

［4］ 國家藥典委員會.中國藥典(2015年版四部).北京：中國醫藥科技出版社, 2015：附錄1105-1106.

Applicability test of microbial limit test for Shuangbai ointment

ZHONG Liu-fang, XIAO Wen-ke, SUN Shu-zhou, et al.
Guangzhou City Panyu District Institute of Food and Drug Control, Guangzhou 511400, China

ObjectiveTo establish microbial limit test for Shuangbai ointment, and perform applicability test.MethodsApplicability test of microbial limit test was made on Shuangbai ointment according to Chinese Pharmacopoeia (2015).Shuangbai ointment was soluble in isopropyl myristate.After dissolution, the membrane was filtered and emulsifier 80 was added into aqueous washing solution.The control bacteria were examined by membrane method.ResultsThe recovery ratio of aerobic bacteria count, fungi and yeasts count in applicability test was all within 0.5-2.The control bacteria grew well and met the requirements of "Chinese Pharmacopoeia" 2015 edition.ConclusionThis method is reliable and feasible, and it can be used in microbial limit test of Shuangbai ointment.

Shuangbai ointment; Microbial limit; Applicability test; Membrane filtration

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.14.114

2017-03-22］

511400 廣州市番禺區食品藥品檢驗所