DNA條形碼鑒定研究

劉 莉、張仕林、楊 飛*、沈開(kāi)文、王 迅

（貴州漢方藥業(yè)貴州省貴陽(yáng)市，貴州 貴陽(yáng) 550000）

DNA條形碼鑒定研究

劉 莉、張仕林、楊 飛*、沈開(kāi)文、王 迅

（貴州漢方藥業(yè)貴州省貴陽(yáng)市，貴州 貴陽(yáng) 550000）

目的 探究應(yīng)用DNA條形碼對(duì)大黃類藥物分類的效果。方法 提取四川、甘肅、青海、西藏、云南、寧夏6省份的40份樣品葉綠體matK基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將不同產(chǎn)地大黃的matK基因進(jìn)行對(duì)比，以進(jìn)行鑒定工作。結(jié)果 將提取的基因序列進(jìn)過(guò)嚴(yán)格仔細(xì)的對(duì)比，能夠發(fā)現(xiàn)40類樣品中細(xì)微的差別。結(jié)論 通過(guò)DNA條形測(cè)序工作可以對(duì)大黃進(jìn)行明確的品種分類。

大黃；matK基因

大黃有非常實(shí)用的臨床藥效，在中醫(yī)臨床中有廣泛的應(yīng)用，其主要的功效為瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等。正品大黃為蓼科大黃屬的唐古特大黃、掌葉大黃或者藥用大黃的根莖。近年來(lái)隨著需求量的增大，以及野生大黃數(shù)量的急劇下降，在藥材市場(chǎng)流通有大量的假冒偽劣產(chǎn)品。中藥材的鑒別一直是一個(gè)熱門的話題，人們長(zhǎng)期尋找一種準(zhǔn)確的鑒別方法。以前大多數(shù)是經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的藥師通過(guò)外觀、氣味等方面進(jìn)行鑒別。這就有非常的主觀性，準(zhǔn)確率比較低。今年來(lái)隨著基因?qū)W的發(fā)展，人們通過(guò)對(duì)大黃基因?qū)W的研究，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)DNA序列的對(duì)比，可以對(duì)大黃進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別和分類。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取產(chǎn)自四川、甘肅、青海、西藏、云南和寧夏6個(gè)省份的40份樣品進(jìn)行鑒定。這些樣本經(jīng)過(guò)專家鑒定為大黃，并保存相應(yīng)的樣本以備查驗(yàn)。

1.2 方法

從大黃藥材根部中間部位選取20 mg，放入研磨器材中，加入液氮經(jīng)過(guò)充分的研磨成粉狀。然后用廣譜植物基因提取試劑盒提取DNA，提取過(guò)程中進(jìn)行充分的水浴，加入AP3緩沖液后高速離心1 min抽取上清液。將得到的DNA在-20℃的環(huán)境下保存待用。

用上海生工生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)的由日本研發(fā)的3對(duì)引物，將目的基因進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。引物信息以及退火溫度詳見(jiàn)表一。反應(yīng)體系的構(gòu)成：滅菌ddH2O 30 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L MgCl24 μL，dNTP4μL，引物各2 μL，DNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶lμL。按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體步驟為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，總共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送到上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序[1]。

2 結(jié) 果

將所得的序列結(jié)果與文獻(xiàn)中提供的序列進(jìn)行分析對(duì)比，將序列100%相同的歸為同一個(gè)基因組，有任何不同的視為不同基因型。某些樣品經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后檢測(cè)不到DNA，這可能是因?yàn)樘崛悠芳兌炔粔颍s質(zhì)過(guò)多影響了引物和相應(yīng)基因的結(jié)合所導(dǎo)致。對(duì)于未檢測(cè)到DNA的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的純化后，再進(jìn)過(guò)相同的流程得出了滿意的結(jié)果。經(jīng)過(guò)基因?qū)W分析大黃的matK基因序列全長(zhǎng)在1518 bp～1524 bp之間，總共發(fā)現(xiàn)57個(gè)變異點(diǎn)，各個(gè)品種間有顯著差異的特異位點(diǎn)區(qū)分。所有大黃的平均遺傳距離為0.0421，最大遺傳距離為0.4521，最小遺傳距離為0.0036[2]。

表1 本研究中所用PCR引物的基本資料

3 討 論

中藥材由于炮制過(guò)程以及純度的問(wèn)題使得DNA的提取難度增大，有些研究中采用對(duì)ITS基因的擴(kuò)增進(jìn)行基因序列的研究，但是ITS除了大黃外，在一些真菌中的含量也十分的豐富。中藥材中常含有不同程度的真菌，因此該基因序列檢測(cè)的準(zhǔn)確度大大降低。而本文中所采用的matK基因就很好的避免了這個(gè)問(wèn)題，使檢測(cè)的準(zhǔn)確性以及可靠性大幅度的增加。本文中的檢測(cè)樣品量還不是十分充足，因此應(yīng)進(jìn)一步的研究，以便達(dá)到更好的鑒定效果。

[1] 李美妮,韓蕊蓮,等.大黃與易混偽品土大黃、虎杖原植物的ITS2序列鑒定[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2012,5(3):185-189.

[2] 張曉芹,劉春生,等.多基原藥材大黃葉綠體matK基因序列分析及鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(11):1722-1728.

本文編輯：李 豆

[Q37]

B

ISSN.2095-6681.2017.08.72.01

科學(xué)技術(shù)部重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)子課題（2014ZX09301308-007）：苗藥芪膠升白膠囊技術(shù)改造及再評(píng)價(jià)研究，負(fù)責(zé)人：劉 莉。貴陽(yáng)國(guó)家高新區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（合同編號(hào)：GXKH2015-20）：芪膠升白膠囊處方藥材DNA條碼的建立項(xiàng)目

楊 飛，執(zhí)業(yè)藥師，主要研究方向：中藥學(xué)。