朝醫(yī)八物君子湯拮抗房顫及對(duì)Cx40、Cx43表達(dá)的影響

金 玉，張默函，洪 蘭，崔昊震

（1. 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

朝醫(yī)八物君子湯拮抗房顫及對(duì)Cx40、Cx43表達(dá)的影響

金 玉1，張默函2，洪 蘭2，崔昊震3

（1. 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

本文通過(guò)觀察朝醫(yī)八物君子湯拮抗房顫及對(duì)心房 肌縫隙連接蛋白Cx 40、Cx43蛋白表達(dá)的影響得出結(jié)論，朝醫(yī)八物君子湯具有拮抗烏頭堿誘發(fā)房顫的作用，其機(jī)制主要與提高Cx40、Cx43蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

朝醫(yī)八物君子湯；房顫；Cx40；Cx43

朝醫(yī)八物君子湯是來(lái)源于《東醫(yī)壽世保元》中的少陰人方劑，其主要組成由人參、黃芪[1]、白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、川芎、陳皮，甘草等8味藥物構(gòu)成，具有補(bǔ)脾和脾，補(bǔ)氣和血之功效，臨床上常可用于治療少陰人驚悸、怔忡等疾病。本研究通過(guò)采用急性房顫模型，觀察和探討八物君子湯對(duì)房顫大鼠心房肌CX40和CX43蛋白表達(dá)、心房肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)變化及對(duì)ANP分泌的影響，旨在闡明八物君子湯拮抗房顫的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均采用雄性SD大鼠（體重為200±20 g）。由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供，合格證號(hào)：SCXK（吉）2011-0007。八物君子湯的8味藥材均購(gòu)自延吉市中醫(yī)醫(yī)院。烏頭堿（美國(guó)Sigma公司）CX40和CX43多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗（北京中山生物技術(shù)公司）；ANP檢測(cè)試劑盒為北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品（批準(zhǔn)號(hào)S10950156）。

1.2 制備八物君子湯提取物

取人參100 g、黃芪、白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、川芎、陳皮、甘草各50 g切碎，分2次煎煮，每次加入10倍量的水，煎煮2 h，將2次濾液混勻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。凍干后，最終獲得黃褐色粉末狀藥物，并儲(chǔ)存于-20℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 急性房顫模型的制備

用20%烏拉坦將雄性SD大鼠麻醉，快速開胸摘取心臟，并剝離左心房，將其固定在Choi等研制的離體搏動(dòng)心房灌流裝置中。同時(shí)給予1.5 Hz的電刺激（電刺激時(shí)間為0.3 ms；電壓為30 V）來(lái)維持體外左心房搏動(dòng)，用氧飽和的HEPES緩沖液[pH 7.4；（mmol·L-1）：NaC1 118，KC1 4.7，CaC12 2.5，MgC1 1.2，NaHCO325，葡萄糖10，HEPES 10，牛血清白蛋白 0.1%]對(duì)左心房組織進(jìn)行持續(xù)性灌流，灌流約60 min心房搏動(dòng)可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。急性房顫模型是在心房灌流模型建立后，先經(jīng)過(guò)1個(gè)正常對(duì)照循環(huán)（12 min）灌流后，繼以烏頭堿（6×10-7mol/L）誘發(fā)房顫的方法制備急性房顫模型，房顫以BL-420S生理記錄儀上顯示出現(xiàn)異常心跳波作為急性房顫模型成功的標(biāo)志。

1.4 動(dòng)物分組及藥物干預(yù)

選擇10只SD大鼠作為正常對(duì)照組，用氧飽和的HEPES緩沖液進(jìn)行5個(gè)循環(huán)（60 min）的持續(xù)灌流。其余30只 隨機(jī)分為AI模型組（6×10-7mol/L）和AI+BJD高劑量組 （1×10-3g/mL）及AI+BJD低劑量組（3×10-4g/mL），每 組各10只。AI模型組在進(jìn)行1個(gè)循環(huán)（12 min）正常灌流 后，進(jìn)行4個(gè)循環(huán)（48 min）的烏頭堿藥物灌流；AI+BJD高低劑量組在進(jìn)行1個(gè)正常循環(huán)（12 min）和2個(gè)循環(huán) （60 min）BJD預(yù)處理后，在BJD持續(xù)灌流的狀態(tài)下給予2個(gè)循環(huán)（24 min）的烏頭堿進(jìn)行灌流。

1.5 烏頭堿誘發(fā)房顫發(fā)生所需時(shí)間檢測(cè)

各組大鼠在急性房顫模型和藥物干預(yù)過(guò)程中，測(cè)定烏頭堿誘發(fā)房顫發(fā)生所需的時(shí)間變化的平均值。

1.6 心房灌流液中ANP分泌量變化檢測(cè)

各組大鼠在急性房顫模型和藥物干預(yù)過(guò)程中，測(cè)定第1（12 min）、第3（36 min）、第5（60 min）循環(huán)結(jié)束前4 min的ANP分泌水平變化的平均值。

1.7 心房組織內(nèi)CX40、CX43蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western-blot法檢測(cè)在急性房顫和藥物干預(yù)過(guò)程中心房組織內(nèi)CX40、CX43蛋白水平變化。灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速取出心房組織，稱重后將根據(jù)組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，并測(cè)定蛋白樣品的濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，電泳分離后用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液封閉PVDF膜上的非特異性位點(diǎn)，并分別加入1∶200稀釋的兔抗大鼠CX40、CX43多克隆一抗（美國(guó)Abcam公司），在4℃孵育過(guò)夜，洗滌后續(xù)加入1∶3000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，在室溫下孵育1h后洗膜。采用圖像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以-actin為內(nèi)參，計(jì)算CX40、CX43蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料均以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 烏頭堿誘發(fā)房顫及藥物干預(yù)后房顫發(fā)生所需時(shí)間變化的影響

各組大鼠在建立急性房顫模型和藥物干預(yù)過(guò)程中測(cè)定房顫發(fā)生所需時(shí)間變化，發(fā)現(xiàn)BJD高、低劑量組均比AI模型組烏頭堿誘發(fā)房顫所需的時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。BJD高劑量組結(jié)果中有4只大鼠沒有出現(xiàn)烏頭堿誘發(fā)房顫，即完全抑制了烏頭堿作用，而低劑量組則未出現(xiàn)完全抑制的結(jié)果，高低劑量組之間相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 八物君子湯拮抗烏頭堿誘發(fā)房顫時(shí)對(duì)ANP分泌的影響

烏頭堿誘發(fā)房顫時(shí)心房明顯增加ANP分泌量（P＜0.05）；BJD預(yù)處理時(shí)均出現(xiàn)ANP分泌量上調(diào)的趨勢(shì)，尤其是高劑量組結(jié)果顯示具有明顯增加心房組織ANP分泌的作用（P＜0.05）；BJD高低劑量組預(yù)處理后，用烏頭堿誘發(fā)房顫，發(fā)現(xiàn)心房組織ANP分泌量明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，BJD高劑量組對(duì)心房組織ANP分泌的抑制作用顯著高于低劑量組（P＜0.05）。

2.3 各組心房組織中對(duì)CX40、CX43蛋白水平變化的影響（見表1）

表1 各組心房組織中對(duì)CX40、CX43蛋白水平變化的影響（±s）

表1 各組心房組織中對(duì)CX40、CX43蛋白水平變化的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較1）P＜0.05；與AI模型組比較2）P＜0.05；與AI+BJD低劑量組比較3）P＜0.05。

組別 劑量 CX40 CX43正常對(duì)照組 - 1.16±0.042 0.87±0.056 AI模型組 6×10-7mol/L 0.23±0.0581） 0.26±0.0671）AI+BJD低劑量組 3×10-4g/mL 0.55±0.0591,2） 0.41±0.0651,2）AI+BJD高劑量組 1×10-3g/mL 0.83±0.0671,2,3） 0.73±0.0621,2,3）

3 討 論

心臟即是泵血器官，又具有內(nèi)分泌功能。ANP是心房組織分泌的，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)水鈉平衡和血液動(dòng)力學(xué)及改善心肌重構(gòu)等重要作用的肽類物質(zhì)。研究表明，房顫上調(diào)心房組織對(duì)ANP分泌量，其機(jī)制可能與房顫時(shí)心房壓力持續(xù)增高，交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，激活血管緊張素Ⅱ受體，介導(dǎo)心房肌細(xì)胞產(chǎn)生增生和間質(zhì)纖維化，進(jìn)而造成心房體積變大，心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)重塑等病理過(guò)程有關(guān)[2，3]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)八物君子湯可有效降低因?yàn)躅^堿誘發(fā)房顫導(dǎo)致的心房組織對(duì)ANP分泌量，且呈濃度依賴性。本研究結(jié)果提示八物君子湯能有效改善房顫導(dǎo)致的心房組織損傷，故出現(xiàn)ANP分泌顯著減弱的狀況。

綜上所述，朝醫(yī)方八物君子湯具有拮抗烏頭堿誘導(dǎo)的急性房顫的作用，其作用機(jī)制可能與抑制心房組織CX40、CX43蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)。另外，八物君子湯成分比較復(fù)雜，其具體的藥效成分及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

[ 1] 李 杰,李俊鋒,魏婷婷.黃芪苷Ⅳ對(duì)心律不齊大鼠的作用及其相關(guān)機(jī)制[J].廣東醫(yī)學(xué),2016,37(14):2076-2079.

本文編輯：劉欣悅

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ISSN.2095-6681.2017.03.70.02

吉林省教育廳“十二五”規(guī)劃項(xiàng)目（吉教科合字[2015]第49號(hào)）；吉林省衛(wèi)生計(jì)生科研課題（NO：2014Q042）；延邊大學(xué)自然科學(xué)基金（延大科合字[2015]第10號(hào)）