護骨膠囊對去卵巢大鼠鈣相關(guān)激素和性腺激素影響的研究

林澤苗 鐘佳賢 賈歡歡 吳玉娥 陳珺 曹祺 曹克廣 李青南，*

1. 廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東 廣州 510663

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于卵巢功能衰退，血內(nèi)雌激素水平下降，致使骨吸收與骨形成加速，從而造成高轉(zhuǎn)換型骨量丟失，結(jié)果導(dǎo)致骨小梁斷裂、穿孔，皮質(zhì)骨變薄，易于發(fā)生骨折的一種疾病[1-2]。去卵巢大鼠的雌激素水平下降，與人類絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松相似。

中藥復(fù)方護骨膠囊為廣東安諾藥業(yè)股份有限公司的產(chǎn)品，由制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、骨碎補、杜仲、續(xù)斷、巴戟天、當(dāng)歸和山藥等中藥根據(jù)中醫(yī)的君臣佐使原則組成。目前在臨床已廣泛應(yīng)用于治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。為深入探討其作用機理，本實驗采用護骨膠囊作用于去卵巢大鼠，觀察大鼠血清中與鈣代謝直接相關(guān)的激素和性激素及子宮的影響，以進一步闡明其預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與實驗環(huán)境

3月齡SPF級雌性 SD大鼠60只，體重(210±3)g (由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：NO.44007200017783)。飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所，室溫為(25±2)℃，濕度為(60±2)%。任意進食大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。

1.2 動物分組與造模

按隨機函數(shù)將大鼠分為6組：假手術(shù)組(Sham)；去卵巢組(OVX)；仙靈骨葆膠囊組(Pos)；護骨膠囊低劑量組(HG-L)；護骨膠囊中劑量組(HG-M)；護骨膠囊高劑量組(HG-H)。每組各10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2w后,用2%戊巴比妥鈉，按45mg/kg 腹腔注射對大鼠進行麻醉，大鼠成功麻醉后，行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。假手術(shù)組按同法操作，僅摘除雙側(cè)卵巢周圍部分脂肪。

1.3 藥物及給藥方法

護骨膠囊由制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補、當(dāng)歸和山藥組成，由廣東安諾藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號為藥準(zhǔn)字Z20040124，批號為20150101，規(guī)格為0.45 g；仙靈骨葆膠囊(陽性藥物)由淫羊藿、續(xù)斷、補骨脂、知母、丹參和地黃組成，由貴州同濟堂制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字Z20025337，批號為20140701，規(guī)格為0.50 g。仙靈骨葆膠囊組每天灌服人體等效劑量的仙靈骨葆膠囊0.270 g/(kg·10ml)。護骨膠囊低、中、高劑量組每天分別灌服0.243 g/(kg·10ml)、0.486 g/(kg·10ml)、0.972 g/(kg·10ml)。其中護骨膠囊中劑量組為人體等效劑量組。

1.4 主要試劑及儀器

試劑：石蠟、二甲苯、無水乙醇、鹽酸乙醇、TO生物型制片透明劑、蘇木精液、伊紅液、中性樹膠。儀器：Leica包埋機、Leica切片機、Leica碳化鎢鋼刀、Leica生物顯微鏡。

1.5 血清性激素的檢測

藥物干預(yù)結(jié)束時，心臟取血處死大鼠，將血液以3000 r/min離心20 min，分離出血清，送至上海邦奕生物科技有限公司，采用Elisa試劑盒檢測血清激素5項：1, 25雙羥維生素D3(1,25(OH)2D3)、甲狀旁腺激素(PTH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)。

1.6 子宮觀察

藥物干預(yù)結(jié)束時，心臟取血處死大鼠，取各組大鼠子宮，稱重后，進行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 OVX及HG對大鼠血清PTH和1,25(OH)2D3的影響

與Sham組比較，OVX組的PTH水平顯著升高(P<0.01)；與OVX組相比，PTH水平在HG-L、HG-M(P<0.01)和HG-H組(P<0.05)減少，HG-H組比HG-L、HG-M組顯著升高，Pos組與OVX組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HG各組均比Pos組降低(P<0.01、P<0.05)。1,25(OH)2D3在此實驗中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠實驗后血清激素指標(biāo)的變化±s，ng/L)Table 1 Changes of serum hormone indexes in rats after ±s，ng/L)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

2.2 OVX及HG對大鼠血清E2、P和T的影響

與Sham組相比，OVX組的E2水平和P水平下降(P<0.01，P<0.05)，T水平升高(P<0.05)。與OVX組相比，E2水平在HG-L和HG-M組增加(P<0.01)，HG-H組無統(tǒng)計學(xué)意義，但HG-H組較HG-L、HG-M組下降(P<0.05)。Pos組與OVX組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HG-L和HG-M組的E2較Pos顯著升高；P水平在Pos組顯著性升高(P<0.01)，在HG-L組減少(P<0.05)，HG-M組和HG-H組無變化。T水平在HG-L組和HG-H組無變化，HG-M組減少(P<0.01)，在Pos組顯著性升高(P<0.01)。見表2。

2.3 OVX及HG對大鼠子宮的影響

Sham組、OVX組、Pos組、HG-L組、HG-M組、HG-H組的子宮重量分別是(0.670±0.19)g、(0.103±0.04)g、(0.097±0.02)g、(0.113±0.04)g、(0.112±0.02)g、(0.114±0.06)g。其中，與Sham組比較，各組的子宮重量均顯著減少(P<0.01)。藥物組的子宮重量與OVX組比無變化。

表2 各組大鼠實驗后血清性激素指標(biāo)的變化±s)Table 2 Changes of serum sex hormone indexes in rats after the experiment(±s)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05,0.01 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

Sham組的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞肥厚，腔大，無明顯增厚及增生；與Sham組比較，OVX組子宮萎縮變小，宮腔變小，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞萎縮；與OVX組比較，HG-L和HG-M組無明顯差異，HG-H組內(nèi)膜稍增厚。Pos組無明顯差異。見圖1。

圖1 各組大鼠實驗后子宮切片(HE染色)。A：假手術(shù)組(5×)；B：去卵巢組(5×)；C：仙靈骨葆膠囊組(5×)；D：護骨膠囊低劑量組(5×)；E：護骨膠囊低中量組(5×)；F：護骨膠囊低高量組(5×)Fig.1 The rats uterus slices after the experiment(HE dyeing). A: Sham(5×);B:OVX(5×);C: Pos(5×);D:HG-L(5×);E:HG-M(5×);F:HG-H(5×)

3 討論

3.1 血清PTH和1,25(OH)2D3分析

PTH和1,25(OH)2D3是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷系統(tǒng)平衡的兩大主要激素[3-4]。本實驗OVX組PTH水平升高，可能是因為大鼠去卵巢后，E2水平下降所導(dǎo)致。研究表明[5]，E2分泌下降，會使骨骼中的鈣結(jié)合力降低，刺激PTH的分泌，PTH激發(fā)升高，作用于骨組織，使間質(zhì)細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進破骨細(xì)胞吸收，使骨鈣釋放入血，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[6]。而HG各劑量組的PTH水平顯著降低，這與補腎化瘀壯骨湯[7]、鹿銜草[8]等對去卵巢大鼠的研究結(jié)果一致。提示護骨膠囊能調(diào)節(jié)去卵巢后的PTH分泌失常。Pos組的PTH水平與OVX組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明仙靈骨葆膠囊不調(diào)節(jié)PTH，這與趙小梅[9]對仙靈骨葆膠囊的研究一致。而實驗各組的1,25(OH)2D3差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，此結(jié)果說明OVX與藥物不是通過血清中的1,25(OH)2D3起作用的。

3.2 血清E2、P和T分析

E2主要由卵巢、黃體和胎盤產(chǎn)生，肝、腎上腺皮質(zhì)及乳房等也能產(chǎn)生少量E2，它是影響雌性動物生殖系統(tǒng)生長發(fā)育，維持雌性性機能的重要類固醇激素[10]。當(dāng)雌激素缺乏時會引起明顯的骨量丟失，骨結(jié)構(gòu)退變以及骨高轉(zhuǎn)換等骨質(zhì)疏松癥狀[11]。本實驗中，OVX組E2水平顯著降低，HG-L和HG-M組則顯著升高，HG-H組E2水平也升高，但與OVX組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明護骨膠囊具有補充性激素的作用，能調(diào)節(jié)去卵巢造成的E2分泌下降，這可能是因為護骨膠囊藥物組成里的淫羊藿、制何首烏和骨碎補等補腎中藥含有植物雌激素。植物雌激素的研究已越來越受到重視。劉仕杰等[12]發(fā)現(xiàn)淫羊藿可提高OVX大鼠血清雌激素水平。楊利娟[13]通過雌激素受體(ERα/β)對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，證明了何首烏的主要活性成分大黃素、骨碎補中的柚皮苷和淫羊藿中的淫羊藿苷都具有顯著的植物雌激素作用，說明護骨膠囊能產(chǎn)生植物雌激素樣作用。Pos組的E2水平與OVX組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明仙靈骨葆膠囊不調(diào)節(jié)血清E2。這與趙小梅[9]對仙靈骨葆膠囊的研究結(jié)果一致。

P是重要的甾體激素，主要在卵巢黃體的顆粒細(xì)胞、胎盤的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成[14]。研究發(fā)現(xiàn)P能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)，促進成骨細(xì)胞增殖與分化、增強成骨功能及骨基質(zhì)合成，促進骨形成[15]。本研究OVX組P水平降低，這與羅曉冰等[16]對OVX大鼠的研究結(jié)果一致。服用護骨膠囊后，大鼠血清P水平不升高，這可能是因為E2能與P競爭性激素結(jié)合球蛋白上的結(jié)合位點，故游離的E2水平升高，P不升高[17]。Pos組P水平顯著升高，提示仙靈骨葆膠囊通過P促進成骨的作用。

T具有促進骨形成與鈣磷沉積的作用，可直接作用于成骨細(xì)胞，還可通過轉(zhuǎn)化為E2間接起作用[18]。P、T和E2均為甾體激素，在體內(nèi)可以通過中間體雄烯二酮進行P→T→E2的轉(zhuǎn)化[19]。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女E2主要來自于腎上腺皮質(zhì)分泌的T在體內(nèi)的轉(zhuǎn)變[20]。故OVX組T升高，可能是由于去卵巢后E2下降，刺激T分泌。與OVX組比，T水平在HG-L和HG-H組無變化；在HG-M組降低，但與Sham組水平相當(dāng)，具體原因有待深入研究；仙靈骨葆膠囊的T水平在OVX組的基礎(chǔ)上顯著升高。有研究表明：T既能增加骨細(xì)胞的增生、分化，又能增加堿性磷酸酶的活性而起成骨作用[21]。本研究的結(jié)果說明仙靈骨葆膠囊通過T促進成骨的作用。

3.3 OVX及HG對大鼠子宮的影響

大鼠切除卵巢后，子宮明顯萎縮。卵巢的功能之一是分泌雌激素，維持子宮功能，雌激素與孕激素等共同作用于子宮內(nèi)膜[22]。故大鼠切除卵巢后，OVX組E2減少，子宮內(nèi)膜變薄，子宮萎縮變小，提示造模成功。護骨膠囊能顯著增加血清E2水平，但子宮與OVX組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，僅高劑量使子宮內(nèi)膜稍增加。其原因可能是護骨膠囊含有的成分為植物雌激素，對子宮的影響很小。這與西藥雌激素的作用不同，研究發(fā)現(xiàn)，長期補充外源性的西藥雌激素，易導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生，水鈉潴留，嚴(yán)重的還會出現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、血栓栓塞等不良反應(yīng)[23]。

綜上所述，護骨膠囊能降低去卵巢大鼠血清的PTH水平，升高E2水平，說明護骨膠囊能調(diào)節(jié)與鈣代謝直接相關(guān)的激素，同時又具有調(diào)節(jié)和補充雌激素的作用，且對子宮影響不大。該研究提示護骨膠囊對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療機理可能是通過調(diào)節(jié)血清中的 PTH和E2的水平，為推廣護骨膠囊臨床防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供了實驗依據(jù)。