1，25(OH)2D3對人骨肉瘤MG63細胞基質GLA蛋白及Wnt信號通路的影響

楊雅 謝菲飛 張潔 符劉晨 符曉玲 賴曉陽

1. 南昌大學第二附屬醫院內分泌代謝科，江西 南昌 330006 2. 贛州市立醫院內分泌代謝科，江西 贛州 341000 3. 南昌大學第二附屬醫院骨科，江西 南昌 330006

骨質疏松是一種骨吸收與形成失衡，骨量減少，骨的微結構破壞，骨強度減退而脆性增加的退化性疾病，發病率隨著年齡的增長而增加。維生素D與骨質疏松發病有密切聯系。維生素D通過促進腸道和腎臟對鈣和磷酸鹽的吸收，這為骨基質的正常礦化提供了充足的礦物質。1，25(OH)2D3/維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)可以促進小腸上磷酸鹽的吸收，特別是磷酸鹽含量低時，能增加II型鈉依賴性磷酸轉運蛋白的表達[1]。此外，1，25(OH)2D3通過作用于成熟的成骨細胞/骨細胞上其同源受體增加LRP5活性促進骨形成，兩者聯合起來直接增加骨小梁量和皮質骨厚度[2]，而流行病學研究資料表明維生素D和骨密度密切相關。Li等[3]對25個研究進行Meta分析，總共4075名中國女性，發現中國絕經后女性的VDR Bsml和Apal多態性和骨密度有明顯聯系。Wang等[4]納入3243名絕經后亞洲女性進行Meta分析發現VDR Fokl多態性與骨密度有關聯，并可以和其他遺傳標志物一起用于識別骨質疏松的高危人群。另外，維生素D可協同雌激素的作用[5]，調節成骨細胞樣細胞的雌激素受體表達和雌激素介導的信號通路[6-7]，還可通過維生素D受體介導上調雌激素的合成[8]。

基質Gla蛋白(marix gla protein，MGP)是14Kda的N-末端γ-羧基化蛋白家族的成員，最初從牛骨骼中分離的維生素K依賴性循環蛋白，富含賴氨酸、谷氨酸殘基，有84個氨基酸，其中包含了5個γ-羧基化的谷氨酸殘基和一個雙硫鍵[9-10]。Cancela等[11]使用MGP cDNA 探針克隆人類MGP基因，長3.9Kb，有4個外顯子，3個長的內含子序列分隔的一種多功能細胞分化調控因子。在骨骼中MGP主要參與骨鈣化調節。MGP基因敲除小鼠出現身材矮小，低骨量，骨質疏松、骨折[12]。日本、韓國等國家關于老年絕經后女性的研究發現MGP基因的多態性與女性絕經后骨質疏松癥有密切聯系[13]。以上結果均提示MGP可能在骨質疏松中有重要的作用。許多與成骨分化相關的蛋白或因子可調節體內MGP的表達。

筆者前期研究已證實1，25(OH)2D3促進原代SD大鼠顱骨成骨細胞及人骨肉瘤細胞MGP的表達[14]，但具體機制仍不清楚。許多研究已經證實了1，25(OH)2D3對Wnt /β-catenin信號傳導通路有促進作用。在成骨細胞、人成骨樣TE-85骨肉瘤細胞上，VDR可以通過增加β-catenin轉錄而調節Wnt信號通路，明顯增強骨的合成代謝[10]但其具體機制仍不清楚。故本研究探討1，25(OH)2D3是否通過Wnt信號通路調節MGP的表達來影響骨形成，為維生素D在骨質疏松的防治機制提出新理論奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤MG63細胞株購自美國培養保存中心(ATCC號：CRL1427)；活性維生素D，美國Sigma公司；DMEM培養基、I型膠原酶(collagenase type I)，美國 Solarbio公司；0.25%胰酶一ED’FA、胎牛血清，美國Gibco公司；25 em2細胞培養瓶、細胞培養板，美國Coming公司；一次性濾器，美國Millipor公司；RNAstore樣本保存液、DP408 RNase-free水，天根生化科技有限公司；DP408-02 RNAiso Plus(D9108S)、PrimeScript@RT reagent kit(Perfect Real Time，DRR037S)、Premix Ex Taqll (Perfect Real TimeDRR039A)及PCR配套試劑，寶生物工程(大連)有限公司，DKK-1美國PeproTech公司；MGP、β-catenin、Runx2、LRP5、GAPDH引物，上海Invitrogen公司；Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：取10代人成骨肉瘤細胞MG63細胞株復蘇，于含5%的CO2、37℃培養箱中培養，培養液為含有10%FBS的無酚紅MEM培養液。細胞達匯片后按5×105細胞/瓶接種于25 cm2培養瓶，細胞培養液每2天換一次。

1.2.2 干預實驗：藥物干預：MG63細胞體積達到90%左右時，改用含0.1%BSA的無血清MEM培養液培養2d，(1)空白對照組：1%BSA+無酚紅MEM培養；(2)10-8M 的1，25(OH)2D3組；(3)200 ng/ml DKK-1組；(4)10-8M 1，25(OH)2D3+200 ng/mlDKK-1組干預48 h。

1.2.3 熒光定量PCR：按Trizol操作步驟提取總RNA。逆轉錄合成cDNA：按照試劑盒(PrimeScript RT reagent kit，TaKaRa)要求操作，取9ulRNA樣本做逆轉錄反應，反應體系20 ul，反應條件：37 ℃ 15 min 85 ℃ 5 s，1個循環，結束。熒光定量PCR反應：管家基因GAPDH作為內參基因，引物均由上海Invitrogen公司設計合成，引物序列見表1。優化反應體系，PCR反應條件：95 ℃預變性3 s,進入循環，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環。每次實驗均設置復孔，重復2次。Ct值代表每個樣本2次重復的平均Ct值。比較目的基因與GAPDH基因的擴增效率的斜率有無顯著性差異，如果沒有，以GAPDH基因作為內參照，利用Ct值，應用比較閾值法，即2-△△CT,(2-△△CT所得結果即表示目的基因相對于對照組的倍數，公式為△△Ct=(CtMGP-CtGAPDH)實驗組-(CtMGP-CtGAPDH)對照組。如果有顯著性差異，按Rasmussen計算出相對表達差異。

表1 各基因的引物序列及產物的長度Table 1 Sequence of the primer of gene

1.2.4 Western-blot雜交：按照蛋白抽提試劑盒操作要求抽提總細胞蛋白，測蛋白濃度，取60 μg細胞總蛋白于SDS-PAGE膠中電泳，電濕轉至PVDF膜上，5%脫脂奶封閉2h，敷育一抗過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗敷育2 h，化學發光增強試劑自顯影，洗片顯帶，雜交信號用Imagemaster VDS成像分析系統行吸光度檢測。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 1,25(OH)2D3對MG63細胞MGP蛋白表達的影響

Western-blot結果顯示(如圖1)：使用1,25(OH)2D310-8mol/l、DKK1 200 ng/ml時，MGP蛋白的表達分別是對照組的1.21倍、0.86倍，差異有統計學意義(P<0.05)。與1,25(OH)2D3相比，與DKK1聯用時MGP蛋白的表達下降0.87倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 1,25(OH)2D3對MG63細胞Wnt/β-catenin信號通路中相關蛋白表達的影響

2.2.1 1,25(OH)2D3及DKK-1對MG63細胞β-catenin蛋白表達的影響：1,25(OH)2D3作用于MG63細胞以后，能明顯提高β-catenin的表達，是對照組的1.13倍，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。DKK-1 200 ng/ml作用于細胞以后，能明顯下調β-catenin的表達0.87倍。DKK-1與1,25(OH)2D3聯用β-catenin蛋白的表達下調0.93倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 western-blot 檢測1，25(OH)2D3及DKK-1對MG63細胞MGP蛋白表達的影響(*P<0.05與對照組相比，**P<0.05與1，25(OH)2D3組相比)Fig.1 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of MGP protein in MG63 cells, detected by western-blot(*P<0.05 compared with the control group,**P<0.05 compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group)

圖2 Western-blot 檢測1，25(OH)2D3及DKK-1對MG63細胞β-catenin表達的影響(與對照組相比*P<0.05，與1，25(OH)2D3組相比**P<0.05)Fig.2 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of β-catenin protein in MG63 cells, detected by western-blot(Compared with the control group*P<0.05, compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group**P<0.05)

2.2.2 1,25(OH)2D3對MG63細胞LRP5蛋白表達的影響：1,25(OH)2D3作用于MG63細胞以后，能明顯提高LRP5的表達，分別是對照組的1.14倍，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。DKK-1 200 ng/ml作用于細胞以后，能明顯下調LRP5的表達0.87倍。DKK-1與1,25(OH)2D3聯合用于LRP5蛋白的表達下調0.92倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 1,25(OH)2D3及DKK-1對MG63細胞Runx2蛋白表達的影響

1,25(OH)2D3作用于MG63細胞以后，能明顯提高Runx2的表達，是對照組的1.17倍，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。DKK-1 200 ng/ml作用于細胞以后，能明顯下調Runx2的表達0.86倍。DKK-1與1,25(OH)2D3聯用Runx2蛋白的表達下調0.87倍，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 1,25(OH)2D3對人骨肉瘤MG63細胞Wnt/β-catenin信號通路中相關基因及MGP基因表達的影響

1,25(OH)2D310-8mol/L作用于MG63細胞以后，能明顯提高β-catenin、Runx2、LRP5、MGP基因的表達，分別是對照組的2.73倍、3.72倍、1.53倍、2.31倍，差異有統計學意義(P<0.05)，如圖5所示。DKK-1 200 ng/ml作用于細胞以后，能明顯下調β-catenin、Runx2、LRP5、MGP基因表達，分別是對照組的0.34倍、0.52倍、0.42倍、0.78倍，表達有顯著差異(P<0.05)。DKK-1與1,25(OH)2D3聯用與單獨使用1,25(OH)2D3相比，β-catenin、Runx2、LRP5、MGP的表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖5 實時熒光定量PCR檢測1，25(OH)2D3及DKK-1對MG63細胞β-cateninm、Runx2、LRP5及MGP基因表達的影響(與對照組相比*P<0.05，與1，25(OH)2D3組相比**P<0.05)Fig.5 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of β-cateninm, Runx2, LRP5 and MGP mRNA in MG63 cells, detected by real time RT-PCR (Compared with the control group*P<0.05, compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group**P<0.05)

3 討論

維生素D是一種惟一由相應的維生素D原經陽光照射由皮膚合成的脂溶性維生素。維生素D對維持骨健康和骨骼功能方面有著重要的作用。成骨細胞上維生素D受體的過表達可影響成骨細胞的生長和分化，從而刺激骨細胞的骨形成和礦化，促進人間充質干細胞和基質細胞成骨分化[15]。體內活性維生素D抑制骨吸收可能存在兩種機制：一是體內長期活性維生素D可能影響鈣的內分泌系統，它以一種復雜的方式抑制成骨細胞上RANKL表達。二是活性維生素D可能降低成骨細胞上RANKL的活性或誘導成骨細胞的細胞結構變化[15]。Lisse等[16]研究發現mi RNA在維生素D對成骨細胞分化和功能的微調效應中起關鍵作用。近來還發現維生素D受體基因多態性與絕經后骨質疏松的發展有關。隨著研究的深入，筆者推測維生素D對骨代謝可能存在新的機制。

MGP是血管和軟骨組織鈣化的抑制劑。在血管鈣化病變中發現MGP調節成骨細胞和軟骨細胞的分化[17]。近年的研究證實MGP與絕經后骨質疏松癥有著千絲萬縷的聯系。筆者的前期動物實驗發現使用雌激素干預去卵巢SD大鼠后大鼠腰椎血清、尿液MGP水平升高，骨密度也增加，由此提示骨密度的增加可能與血清MGP水平的增加有關，兩者之間有密切聯系[18]。PTH、維生素K、雌激素等治療骨質疏松癥的藥物能調節MGP的表達[14]。Tuón-Le Poultel等再次證實了男性MGP基因變異可能預測骨量丟失進展的高風險[19]。以上臨床研究均提示MGP與骨密度存在密切聯系。本研究中使用10-8M 1,25(OH)2D3干預骨肉瘤MG63 48h后，與對照組相比MGP蛋白及基因的表達增加。前期研究也顯示1,25(OH)2D3呈劑量依賴性增加原代SD大鼠顱骨成骨細胞MGP mRNA的表達[14]。James等[20]通過放射免疫法及Northern blot技術檢測證實1,25(OH)2D3能呈濃度和時間依賴性刺激骨肉瘤細胞株UMR106-01、ROS 25/1、ROS 25/4的MGP mRNA表達，經1,25(OH)2D3干預后MGP表達增加6～15倍。以上研究結果均與本研究一致，1,25(OH)2D3可上調MGP的表達。原代成骨細胞及本研究的細胞株體外實驗結果共同證實了維生素D對可調節MGP的表達，但1,25(OH)2D3具體通過何種途徑調節MGP的表達尚不清楚。

Wnt/β-catenin信號通路對骨代謝有非常密切的聯系[21-22]。Wnt信號通路可間接調節破骨細胞功能及抑制分化并促進成骨細胞分化，維持正常骨密度和骨礦物沉積。β-catenin、LRP5等相關因子的丟失可能是骨質疏松發生的重要原因。近年研究發現Wnt/β-catenin信號通路與絕經后骨質疏松癥相關。1,25(OH)2D3可以增加Wnt/β-catenin信號通路中相關因子β-catenin、LRP5、Runx2的表達。本研究中使用10-8M 1,25(OH)2D3干預骨肉瘤MG63細胞 48h后，與對照組相比Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、LRP5、Runx2蛋白及基因的表達都增加了，由此提示1,25(OH)2D3可上調骨肉瘤MG63細胞中Wnt/β-catenin信號通路中相關因子的表達。本研究結果與Royan等[27]結果一致，不僅發現1,25(OH)2D3可促進Wnt/β-catenin信號通路中相關因子的表達，而且還發現在促進β-catenin、Runx2表達的同時，也上調了MGP的表達。1,25(OH)2D3可通過促進Wnt/β-catenin信號通路的核心β-catenin與T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)整合而上調Runx2，促進間充質前體細胞的成骨細胞分化，并可通過Wnt刺激成骨細胞釋放OPG，降低RANKL的表達，因此也降低破骨細胞生成和破骨細胞的激活、促進破骨細胞的凋亡從而促進骨的合成代謝、抑制骨的吸收[23-25]，這可能是維生素D維持骨量和骨骼強度的機制之一，維生素D有可能通過影響Wnt/β-catenin信號通路調節MGP的表達。

近來生化和遺傳研究認為，DKK1作為Dickkopf家族中的一員，是一種天然的可溶性Wnt信號通路抑制劑，直接或間接通過與受體復合物的LRP5/6競爭性結合抑制Wnt信號通路，破壞成骨細胞分化。DKK1作為β-catenin/TCF途徑的下游目標，參與了Wnt信號通路的負反饋[26]。DKK1缺失的人和鼠可導致骨形成的增加[27]。轉基因大鼠過度表達Wnt蛋白拮抗因子DKK1可出現成骨細胞數目的急劇下降，也降低了骨鈣素的表達[28]。為進一步證實筆者的推論，使用DKK1從另一方面驗證Wnt/β-catenin信號通路是否對MGP存在影響。DKK1組與對照組相比，抑制β-catenin、Runx2、LRP5表達的同時也下調了MGP的表達，由此提示Wnt/β-catenin信號通路受到DKK1抑制時，MGP的表達也下調，MGP的表達可能受到了Wnt/β-catenin信號通路的影響。Alfieri等[29]使用成骨細胞培養基和Wnt拮抗劑sFRP3共同培養主動脈瓣膜間質細胞后可減弱對MGP的誘導表達，主動脈瓣間質細胞Wnt信號通路的增加可導致骨膜蛋白和MGP的表達。Fazenda等[30]在體內、外實驗都證實了MGP是Runx2的主要靶基因，外源性Runx2過表達可上調MGP轉錄和表達。本研究結果與之前研究結果均提示Wnt/β-catenin可影響MGP的表達，但具體機制有待進一步證實。

由此可見，維生素D可同時促進Wnt/β-catenin信號通路中相關因子及MGP的表達，而Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK1則抑制信號通路同時下調MGP的表達，推測維生素D可能通過Wnt/β-catenin信號通路調節MGP的表達，這可能為維生素D對于防治骨質疏松癥機制研究提供了新方向，但深入的機制仍需有待進一步研究。