骨硬化蛋白單克隆抗體對于有去卵巢大鼠骨折愈合影響的實驗研究

謝輝

湖北省荊門市第一人民醫院創傷手足外科，湖北 荊門 448000

骨質疏松骨折已經成為公共衛生問題，約有40%～50%的女性和13%～22%的男性一生中出現骨質疏松骨折，防治骨質疏松對臨床醫生來說是一項巨大的挑戰[1]。由于低骨密度(BMD)，骨強度降低，骨組織脆性增加，骨質疏松性骨折延遲愈合，不愈合等并發癥的風險明顯增高[2]。經典Wnt信號/β-聯蛋白途徑在骨折的愈合中發揮重要的作用已被人們熟知，骨硬化蛋白(Scl)，是由Wnt信號通路傳導中骨細胞分泌的糖蛋白的抑制劑，已被證明是骨量和骨形成的關鍵負調節物[3]。最近的研究[4]表明，骨硬化蛋白單克隆抗體(Scl-Ab)有助于增加去卵巢(OVX)大鼠的骨量。綜上所述，我們假設，Scl-Ab也可能有助于骨折部位增加骨量，骨強度和骨形成促進OVX大鼠骨折的愈合。

本研究通過使用骨硬化蛋白單克隆抗體來治療去卵巢大鼠股骨干骨折，觀察其療效，為臨床上此抗體的使用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

骨硬化蛋白單克隆抗體(MSD 公司)，Micro-CT (SkyScan1176，荷蘭)，手術操作器械(美國史塞克醫療器械公司)。鈣黃綠素 (sigma, 美國)，硬組織切片機(EXAKT300，德國)，顯微鏡(ZEISS Axio Imager M1，德國)，Image-Pro Plus全自動圖像分析儀(Media Cybernetics，美國)，骨密度測量儀(法國DMS公司，Lexxos)。

1.2 方法

1.2.1 骨質疏松動物模型的建立：30只健康的雌性Sprague-Dawley大鼠(3月齡，體重 220～240 g。由上海實驗動物中心提供)用于去卵巢(OVX，n=25)制作骨質疏松模型和假手術(Sham,n=5)。手術開始前，所有大鼠稱重，根據體重，適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)進行麻醉，麻醉成功后，于大鼠背部正中線中下 1/3處作一長約 2 cm 縱行切口，向兩側鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開0.5 cm處鈍性分開肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處絲線結扎，完整摘除雙側卵巢，逐層縫合，關閉創口。

1.2.2 股骨干骨折模型的建立：適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)進行麻醉，麻醉成功后，常規消毒，取左下肢髕骨外側緣縱行切口，長約 1 cm，逐層切開皮膚及部分股四頭肌腱性組織，屈曲膝關節并向內側脫位髕骨，充分顯露股骨髁間凹。從股骨髁間凹處逆行插入 1 根 5 mL注射器針頭沿髓腔至股骨粗隆間。剪斷多余的針頭，并將其遠端埋于股骨髁間骨皮質下。碘伏及生理鹽水反復沖洗切口后，使用 3～0 絲線逐層縫合切口。 將動物左下肢外展內旋位固定于造模支架上， 通過三點彎曲實驗的原理打擊大腿中部，致股骨中斷橫行骨折。

1.2.3 術后護理及藥物治療：術后前3 d給予青霉素肌肉注射(2. 5 萬U/kg)預防感染。正常環境下飼養12 w后各組取5只大鼠處死股骨行骨密度測量儀檢測來檢驗骨質疏松建立模型建立情況。隨后所有的去卵巢(OVX)大鼠隨機的分成兩組：OVX組、Scl-Ab組。術后第1天開始給予藥物治療：Scl-Ab組：Scl-Ab皮下注射(劑量25 mg/kg，每w 2次)，OVX組注射相同劑量的生理鹽水，直至8 w，每周稱量大鼠體重，根據體重變化來調整藥物劑量。所有大鼠在處死前第 13天以及處死前第3天, 分別腹腔內注射15 mg/kg劑量的鈣黃綠素。本實驗所使用的藥物劑量參考以前發表的治療骨質疏松效果明顯的文獻中所使用劑量[5]。

1.2.4 Micro-CT檢測：將骨折術后8w股骨標本置于掃描床上，掃描參數設置:電壓50 kV，電流500 μA，掃描方式為360°旋轉，曝光時間250 ms，圖像平面分辨率1024×1024。每次掃描約持續10 min，掃描完成后，選擇圓柱形的骨折區域為感興趣區(region of interest， ROI)，得到骨折端新生骨組織的三維圖像，并用Micro-CT內置軟件(CT An software)進行定量分析，獲得大鼠骨折區域骨微結構參數骨體積分數 (bone volume/total volume， BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb． Th)、骨小粱數量(trabeculae number， Tb． N)、骨小粱分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)。

1.2.5 骨折處組織切片：待所有股骨經過Micro-CT檢測后，去掉股骨內置針頭后，部分標本用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，甲基丙烯酸甲酯包埋。包埋塊修整后置于硬組織切片機沿脛骨縱軸冠狀面切片，清洗打磨拋光，切片最終厚度約為30～40 μm，切片在熒光顯微鏡及Image-Pro Plus 6.0 全自動圖像分析儀對骨礦化沉積率(MAR) 進行計算。剩下的部分標本放置在 EDTA 脫鈣液中浸泡，每3～4天換液1 次，連續脫鈣4 w，X 線檢測是否脫鈣完全，然后充分水洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋， 切片，HE染色，OLYMPUS BX5l多功能顯微鏡下觀察新生骨生長情況，骨小梁的微觀結構及分布。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 手術對大鼠的影響

截止到實驗截止時間，有2只大鼠由于手術不當、麻醉不當和傷口感染死亡，它們其中1只屬于OVX組，一只屬于Scl-Ab，最終共有18只去勢大鼠進入最終試驗結果評估。術后12 w時兩組大鼠股骨的骨密度變化骨密度測量儀檢測所得，Sham組大鼠的股骨骨密度為233.21±29.78 mg/cm2，而OVX組大鼠股骨骨密度為167.24±27.31 mg/cm2。相對Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降42.59%(P<0.05)，結果表明我們的骨質疏松模型建立是成功的。

2.2 Micro- CT圖片及骨微觀參數檢測

我們通過Micro- CT對骨折端感興趣區域進行掃描的結果如圖1所示，通過內置軟件計算的骨微觀參數如表1所示。我們可以通過觀察圖1 明顯的發現相對而言Scl-Ab組骨小梁的數量明顯多于OVX組，而且骨小梁聯系緊密，骨小梁更粗。骨微觀參數更加明顯的表明Scl-Ab組有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和最低Tb.Sp，而OVX組有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N。和OVX組比較，Scl-Ab組骨微觀參數有明顯的統計學意義，這些表明聯合使用Scl-Ab可以明顯增加去卵巢大鼠骨折端新生骨組織的生成，加速骨折的愈合。

圖1 藥物治療8 w時OVX組及Scl-Ab組大鼠股骨干骨折端Micro-CT掃描結果Fig.1 Micro-CT results of the femoral shaft fracture site in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatment

ParameterScl-AbOVXTb.N3.234±0.115*2.124±0.090Tb.Th0.198±0.016*0.118±0.011BV/TV0.534 ±0.013*0.178±0.016Tb. Sp0.412±0.037*0.657±0.129

注：與OVX組比較。*P<0.05

2.3 組織切片觀察結果

大鼠左側股骨切片經過HE染色結果如圖2.A所示，我們可以清楚發現Scl-Ab組骨折處新生骨的量遠遠大于OVX組，且新生骨之間聯系緊密，排列有規律，這表明Scl-Ab明顯加速骨折端新生骨組織的形成，HE切片的觀察結果進一步證實Micro-CT的結果。熒光共聚焦顯微鏡的觀察的結果如圖2.B所示，通過Image-Pro Plus 6.0 計算OVX組、Scl-Ab組骨礦化沉積率(MAR)結果如下：0.80±0.09、1.56±0.10；通過SPSS軟件統計表明各組之間有統計學意義(P<0.05)，這表明聯合使用Scl-Ab可以加速骨折端新生骨組織的礦化。

圖2 A. 藥物治療8周時OVX組及Scl-Ab組骨痂HE染色切片B. 藥物治療8周時OVX組及Scl-Ab組骨痂礦化情況Fig.2 A. HE staining in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatmentB. Mineralization of the callus in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatment

3 討論

本研究通過去卵巢手術來建立骨質疏松模型，正常狀況下飼養3月后通過檢測股骨骨密度變化情況來確保骨質疏松建立是成功的；隨后通過三點彎曲原理建立閉合股骨中斷橫行骨折，通過使用Scl-Ab來治療去卵巢誘導的骨質疏松骨折，Scl-Ab使用8w后處死大鼠取股骨行Micro-CT、硬組織切片等評估；我們的實驗結果表明Scl-Ab可以明顯增加去卵巢大鼠股骨干骨折處新生骨組織的生成，加速骨折的愈合以及骨質的礦化。

本實驗主要研究的是原發性骨質疏松狀態下的骨折，原發性骨質疏松分為絕經后骨質疏松和老年性骨質疏松。絕經后骨質疏松主要由于雌激素的不足，因此，骨形成較快，但破骨更快，屬于高轉化型。老年型骨質疏松，骨量丟失較慢，屬于低轉化型[6]。但無論哪種骨質疏松癥，骨形成和骨吸收的平衡打破了，都將影響骨質最終導致一系列的病理性骨折如做常見的骨質疏松骨折，因此其骨折愈合能力大大下降。目前可以促進骨質疏松骨折愈合的藥物繁多，但均存在各自的局限性。雖然雙膦酸鹽類、甲狀旁腺素類藥、地諾單抗在治療骨質疏松骨折中都有不錯的療效，但是常常會出現一些不利因素影響其臨床應用，如雙膦酸鹽類人體吸收率低，不適用于有血栓栓塞性疾病或腎功能不全者[7]；地諾單抗使用時出現下頜骨壞死率[8]；甲狀旁腺素需皮下注射，應用不便，且不可用于骨骺線尚未閉合的青少年患者[7]。

本實驗選用的治療骨質疏松骨折的藥物Scl-Ab在治療骨質疏松癥也有著不錯的效果，是目前治療骨質疏松癥一種非常有潛力的一種藥物[4]。Scl是由SOST基因編碼，具有通過Wnt通路負向調節骨形態發生蛋白活動及骨代謝，是導致骨質疏松的原因之一。Scl-Ab可以可拮抗骨硬化蛋白對骨形成的負向調節作用，在抑制骨量丟失的同時促進骨生成。在本實驗中的Scl-Ab組8w時,可以看見大量排列整齊且成熟的編織骨形成，且骨組織之間聯系緊密,而OVX組股骨干骨折處新生骨組織排列紊亂稀疏,且骨組織之間聯系不緊密.同時,本試驗還利用Micro-CT測定各組的新骨圍觀, Scl-Ab組的新骨密度要明顯高于OVX組 (P<0.05)。通過Micro-CT對骨微觀結構的觀察中，發現Scl-Ab組與OVX組比較中，在骨小梁體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)都增高(均P<0.05)，骨小梁分離度(Tb.Sp)降低(P<0.05)，表明Scl-Ab在增加骨折端骨量的同時也改善了骨質量。硬組織切片進一步證實Micro-CT的結果，同時我們發現Scl-Ab明顯可以加速新生骨組織的礦化，增加骨質強度。

本次試驗也有其局限性，首先我們實驗使用的大鼠數量有限，且時間較短，8w之后動物骨質疏松的具體情況不知。我們沒有從生化角度進一步觀察Scl-Ab加速骨折愈合的具體改變，同時也沒有進一步探索機制。但是這次試驗從體內很好的證實Scl-Ab可以促進骨折端骨量的增加、加速骨組織的礦化及加速骨質疏松骨折的愈合，為其在臨床上骨質疏松骨折的愈合治療使用提供了理論基礎。