漢黃芩素通過激活活性氧簇介導的p38MAPK信號通路誘導類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡

王慧蓮 孟慶良 李松偉 王濟華

1. 河南省中醫院風濕病科，河南 鄭州 450000 2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科，河南 鄭州 450000

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫疾病，主要病理表現為炎癥的反復發作、滑膜組織過度增殖和功能異常，最終引起關節纖維化和關節功能障礙[1]。已經證實成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)可表現出轉化細胞的特征，呈類腫瘤細胞樣異常增殖，侵入到軟骨和軟骨下的骨質，并產生炎性介質、分泌基質金屬蛋白酶等，其過度增殖在RA的發病過程中起到了重要作用[2-3]。因此，誘導人成纖維樣滑膜細胞的凋亡是治療RA的主要靶點。目前臨床上多采用甲氨蝶呤、環磷酰胺等抗腫瘤藥物治療RA患者，雖然療效明顯，但都有不良反應多或價格昂貴等缺點，增加了患者的痛苦和經濟負擔[4]。本研究從中醫中藥的角度研究漢黃芩素對人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS)凋亡的影響，探討漢黃芩素對RA潛在的治療作用。

1 材料和方法

1.1 樣本與試劑

采集2015年6至12月河南省中醫院風濕科收治的7例RA患者關節積液標本，其中男4例、女3例；年齡38～62歲，平均55.7歲。入選標準：確診診斷均符合2010年ACR/EULR分類標準。排除標準：①合并感染者；②伴隨慢性心、肝、腎功能不全者；③合并其他自身免疫性疾病者；④合并冠心病患者；⑤合并血液系統疾病患者。所有患者均簽署知情同意書。體外原代培養人成纖維樣滑膜細胞。

DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、DCFH-DA和羅丹明123熒光染料購自美國Sigma公司，Annexin V/FITC 細胞凋亡試劑盒和活性氧清除劑(NAC)購自上海碧云天生物技術研究所，p38MAPK抑制劑 (SB203580)購于美國Calbiochem公司，漢黃芩素購自南京郎澤醫藥科技有限公司(純度大于98.0%)，p-p38MAPK、p38MAPK及β-actin 的單克隆抗體及辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 成纖維樣滑膜細胞的分離與培養

無菌采集患者關節腔積液30 mL，1000 r/min 離心10 min，棄上清后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)重懸沉淀，經100目篩網過濾，將濾液以1000 r/min 離心10 min，再以PBS清洗沉淀2次后，用含有10%的胎牛血清及青霉素和鏈霉素各100U的DMEM 培養基重懸細胞，用計數板計數細胞。將收集的細胞接種于25 cm2的培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。12 h更換一次培養液，去除非貼壁細胞，重復2～3次。3 d后倒置顯微鏡下觀察，細胞呈梭狀成纖維樣。用胰蛋白酶法收集滑膜細胞，按細胞密度5×105個/L復種于25 cm2塑料培養瓶中。后續用于實驗的細胞為3～5代生長穩定的成纖維樣滑膜細胞。

1.3 細胞處理與分組

將純化培養的成纖維樣滑膜細胞按照1×103個/L接種于平底48孔板中，待細胞生長至80%時進行處理并分組。(1)正常對照組：不加任何藥物處理，常規培養；(2)低劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為20 μg/mL；(3)中劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為50 μg/mL；(4)高劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為100 μg/mL；(5)100 μg/mL漢黃芩素+ N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)組：細胞先加入終濃度為5 mmol/L活性氧的清除劑NAC處理12 h，然后再加入漢黃芩素，使其終濃度為100 μg/mL；(6)100 μg/mL漢黃芩素+SB203580組：細胞先加入終濃度為10 μmol/L p38MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)抑制劑SB203580處理12 h，再加入漢黃芩素使其終濃度為100 μg/mL。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

取待測組對數生長期的細胞，調整細胞濃度以5×104個/mL接種于96孔板中，同時設定陰性對照孔(即不加細胞按照同步驟處理)，各自培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT20 μL，繼續培養4 h，棄掉上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，在酶標儀上檢測490 nm處吸光度[光密度(optical delnsity，OD)值]。每組同時設置5個重復孔。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

調整待測組細胞濃度為1×106個/mL，取200 μL 細胞懸液，FITC標記的Annexin-V和PI各5 μL 混勻后避光孵育20 min，低速離心收集細胞，150 μL PBS重懸細胞，用流式細胞檢測儀上樣檢測各組成纖維樣滑膜細胞凋亡率。

1.6 細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)含量的測定

Rh123是一種可被線粒體吸收的綠色熒光染料，其吸收值隨細胞MMP的改變而變化，因此本實驗根據熒光強度來間接反映MMP的高低。將100 μL待測組細胞接種于6孔培養板中，細胞生長融合至80%時，棄掉培養液，PBS清洗3次，加入10 μg/L Rh123于37 ℃避光孵育45 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選擇3個不同區觀察其熒光，并用ImageJ 1.41軟件分析各視野下平均熒光強度，對各組細胞的每個樣本進行統計學分析。

1.7 細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量的檢測

DCFH-DA能夠自由通過細胞膜，被細胞內的ROS氧化成有熒光的DCF，本研究通過觀察DCF的熒光強度分析細胞內ROS的水平。將100 μL待測組細胞接種于6孔培養板中，細胞生長融合至80%時，棄掉培養液，PBS清洗3次，加入10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃避光孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選擇3個不同區觀察其熒光，并用ImageJ 1.41軟件分析各視野下平均熒光強度，對各組細胞的每個樣本進行統計學分析。

1.8 Western blot分析p38MAPK相關蛋白的表達

收獲待測組細胞，加裂解液提取蛋白，BCA 法進行總蛋白定量。調整上樣量為25 μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉膜，封閉過夜。封閉完畢后PBS 洗膜5次，分別加一抗(所用的一抗稀釋比例分別為p-p38MAPK抗體11000、p38MAPK抗體11000)，37 ℃反應1.5 h，PBS洗膜5次，加辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃反應1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR 凝膠成像系統依次顯影、定影，Quantity One Basic 軟件分析膠片蛋白條帶。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 細胞培養結果

7例患者的關節滑液經處理后均成功獲得大量成纖維樣細胞，經鑒定該細胞為CD68陰性細胞，即人成纖維樣滑膜細胞。經過反復貼壁與傳代3代后，細胞純度達到90%以上，體外生長穩定，顯微鏡下觀察細胞形態基本為長梭形，胞質透亮、均勻，細胞輪廓清晰，適合后續實驗(見圖1)。

圖1 光鏡下成纖維樣滑膜細胞形態觀察(×200)Fig.1 Morphology of RA-FLS under light microscope (×200)

2.2 漢黃芩素抑制RA-FLS細胞增殖

與正常對照組相比，不同濃度漢黃芩素處理后RA-FLS細胞各個時間點在490 nm下OD值均明顯減少，并且呈現劑量依賴性關系，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.3 漢黃芩素誘導RA-FLS細胞凋亡

與正常對照組細胞凋亡率(7.69±1.46)%比較，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細胞凋亡率依次為(12.32±1.65)%、(15.89±2.17)%和(19.16±2.13)%，組間差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

表1 MTT法檢測各組細胞的增殖(OD值，Table 1 Proliferation of RA-FLS in each group detected with MTT assay (OD Value,

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05。

圖2 不同濃度漢黃芩素對RA-FLS細胞凋亡的影響Fig.2 The effect of wogonin with different concentrations on the RA-FLS apoptosis

2.4 漢黃芩素降低RA-FLS細胞MMP水平

與正常對照組細胞Rh123的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)(反應MMP大小的指標)(43.56±2.45)%相比，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細胞中Rh123的MFI數值依次為(38.37±2.31)%、(32.76±2.89)%和(27.98±1.98)%，組間差異具有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.5 漢黃芩素增加RA-FLS細胞內ROS生成

與正常對照組細胞中DCF的MFI(5.65±0.91)%相比，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細胞中DCF的MFI數值依次為(9.28±1.02)%、(12.47±1.24)%和(15.89±1.14)%，組間差異具有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.6 漢黃芩素通過激活p38MAPK信號通路誘導細胞凋亡

與正常對照組相比，不同劑量漢黃芩素均能夠上調p-p38MAPK蛋白水平，并且呈現劑量依賴性關系，但并不影響p38MAPK總蛋白水平。與100 μg/mL漢黃芩素組相比，100 μg/mL漢黃芩素+SB203580組中細胞p-p38MAPK蛋白水平明顯降低，同時細胞凋亡也明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖3、4)。

表2 不同劑量漢黃芩素對RA-FLS細胞MMP和ROS水平的影響Table 2 The effect of wogonin with different concentrations on the levels of MMP and ROS in RA-FLS

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05。

2.7 漢黃芩素通過介導ROS生成而激活p38MAPK信號通路

與100 μg/mL漢黃芩素組相比，100 μg/mL漢黃芩素+NAC組p-p38MAPK蛋白水平顯著降低，同時細胞凋亡率也顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖3、圖4)。

圖3 各組細胞中p38MAPK信號通路中相關蛋白檢測Fig.3 The protein levels of p38 MAPK in each group detected with Western blotting注：與正常對照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05；與100 μg/mL漢黃芩素組相比，aP<0.05。

圖4 SB203580和NAC對RA-FLS細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of SB203580 and NAC on the apoptosis of RA-FLS

3 討論

RA是目前臨床上比較常見的一種自身免疫性疾病，病因復雜。研究表明人成纖維樣滑膜細胞過度增生和分泌是RA發病的重要基礎，參與關節的炎性反應和關節破壞[5]。因此，有效抑制成纖維樣滑膜細胞的增殖、誘導其凋亡能夠為臨床治療RA提供新的靶點和思路。漢黃芩素是從常見中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和神經保護等作用[6]。已經證實漢黃芩素能夠誘導多種細胞的凋亡，例如白血病多藥耐藥細胞株K562/A02細胞和肝癌HepG2細胞[7-8]。本研究探討漢黃芩素對成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響以及可能的作用機制。

本研究中首先分離純化培養RA患者的成纖維樣滑膜細胞，經過不同濃度漢黃芩素處理后，MTT實驗和流式細胞術均證實漢黃芩素能夠明顯抑制成纖維樣滑膜細胞的增殖并誘導其凋亡，并且呈現劑量依賴性關系。已知細胞凋亡的途徑有多種，其中線粒體損傷介導的凋亡是最常見的凋亡，主要表現為線粒體膜電位的缺失和細胞內ROS的生成。本研究在探索漢黃芩素對RA-FLS細胞凋亡機制中發現，不同劑量漢黃芩素均能夠降低細胞線粒體膜電位，同時增加細胞內ROS的生成量，并且呈現劑量依賴性關系。這表明漢黃芩素通過誘導線粒體損傷來增加細胞的凋亡。

p38MAPK蛋白是MAPKs蛋白激酶家族的主要成員之一，絲氨酸/酪氨酸殘基可被磷酸化，細胞外多種應激原都可引起細胞內蛋白激酶的連鎖反應，從而影響細胞的基因轉錄、蛋白合成和細胞表面受體表達等生物效應，在細胞凋亡中發揮著舉足輕重的作用[9-10]。已有研究表明細胞內ROS生成量的增加誘導的細胞凋亡與p38MAPK信號通路密切相關[11-12]。本研究中發現不同劑量漢黃芩素能夠上調p38MAPK磷酸化水平，但不影響p38MAPK總蛋白的表達。加入p38MAPK抑制劑SB203580降低細胞中p38MAPK磷酸化水平，同時能夠明顯逆轉漢黃芩素誘導的RA-FLS細胞凋亡，這表明漢黃芩素通過激活p38MAPK信號通路誘導RA-FLS細胞的凋亡。另外，加入ROS清除劑NAC能夠抑制p38MAPK的磷酸化，阻斷漢黃芩素誘導的細胞凋亡。因此筆者推斷ROS生成的增加能夠誘導p38MAPK信號通路的激活，介導了漢黃芩素對RA-FLS細胞凋亡的誘導作用。

綜上所述，漢黃芩素能夠通過誘導成纖維樣滑膜細胞中ROS的產生，繼而激活p38MAPK信號通路而介導細胞線粒體損傷相關的凋亡。