rhEPO通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT5信號通路減少大鼠腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡

梁俊君　王亞冰　辛海濱

[摘要]目的 探討重組人促紅細(xì)胞生成素rhEPO是否通過JAK2/STAT5信號通路減少腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。方法 將8周齡的Wistar雄性大鼠30只隨機(jī)分3組：假手術(shù)組、ICH模型組、rhEPO組，每組10只。ICH模型組大鼠進(jìn)行ICH造模，假手術(shù)組除不注血外，其余步驟同ICH模型組，rhEPO組術(shù)后5 min給予腹腔注射rhEPO，所有動物24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分，收集大鼠腦組織，利用原位缺口末端標(biāo)記法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化；采用免疫組織化學(xué)SP法檢測凋亡蛋白Caspase3表達(dá)；并采用Real-time PCR和Western blot檢測磷酸化JAK2、磷酸化STAT5基因和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 手術(shù)建立腦出血模型后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分。按 Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)判定，ICH 組4只評價為1分，3只評價為2分，2只評價為3分；rhEPO組治療后，5只評價為1分，2只評價為2分，1只評價為3分，說明rhEPO可以改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷，恢復(fù)神經(jīng)功能。與假手術(shù)組相比，ICH模型組和rhEPO組中神經(jīng)元凋亡細(xì)胞及Caspase3的蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多（P<0.05），而rhEPO組中凋亡細(xì)胞與ICH模型組相比明顯減少（P<0.05）；與假手術(shù)組相比，ICH模型組和rhEPO組中JAK2和STAT5的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)顯著上升（P<0.05），與ICH模型組相比，rhEPO組中JAK2和STAT5的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 外源性rhEPO可以通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT5信號改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷，對于神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]rhEPO；腦出血；神經(jīng)保護(hù)；JAK2/STAT5 信號通路

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（a）-0008-05

[Abstract]Objective To investigate whether recombinant human erythropoietin （rhEPO） could decrease neuron apoptosis after cerebral hemorrhage by regulating JAK2/STAT5 signaling pathway.Methods 30 Wistar male rats of 8 weeks old were randomly divided into 3 groups：sham operation group，ICH model group and rhEPO group，the rats in ICH model group were treated with ICH.In the sham operation group，the treatment were same as ICH group except blood injection.rhEPO group was injected with rhEPO at 5 min after operation.All animals were scored with neurological score at 24 h after the ICH model was established.The effect of neuronal apoptosis were detected by TUNEL staining.The expression of pro-apoptosis protein Caspase3 was detected by immunohistochemistry.The expressions of JAK2 and STAT5 mRNA and protein were measured by Real time PCR and Western blot.Results Neurological score was performed 24 hours after the establishment of the intracerebral hemorrhage model.According to the criteria of Longa5 standard，in ICH group，four rats were evaluated as score 1，three rats were rated as score 2 and two rats were rated as score 3.In rhEPO group，five rats were evaluated as score 1 and two rats were rated as score 2，one rat were rated at score 3，indicating that rhEPO can ameliorate neuronal damage and restore nerve function after intracerebral hemorrhage in rats.Compared to sham group，the quantity of apoptotic cells and the expression of Caspase3 in ICH model group and rhEPO group were significantly increased （P<0.05），while the apoptotic cells in rhEPO group were significantly down-regulation compared with the ICH group （P<0.05）.Compared with the sham group，the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in ICH group and rhEPO group were significantly up-regulated （P<0.05），while the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in rhEPO group were decreased significantly compared to ICH group （P<0.05）.Conclusion rhEPO reduce neuronal apoptosis by regulating JAK2/STAT5 signal after cerebral hemorrhage，and has protective effect on the nervous system in rats .

[Key words]rhEPO；Intracerebral hemorrhage；Neuroprotection；JAK2/STAT5 signal pathway

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦卒中中的第二大類疾病，腦卒中患者中15%的患者是腦出血疾病[1]。腦出血特點(diǎn)是進(jìn)展較快、高致殘率和高死亡率[2]。據(jù)報道，腦出血病號的死亡率高達(dá)40%，腦出血后細(xì)胞的死亡會造成腦出血后對腦的二次損傷[1]。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成的一種細(xì)胞因子，之前的研究報道表明EPO對腦以及身體其他器官有保護(hù)作用。EPO對實(shí)驗(yàn)性的腦梗死、缺血再灌注損傷均有保護(hù)作用[3-4]。EPO可以通過磷酸化激活A(yù)KT信號通路提高腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的生存率[5]，但對于EPO是否可以保護(hù)腦出血后神經(jīng)細(xì)胞以及相應(yīng)的機(jī)制研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在探討外源性rhEPO對于神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，采用大鼠腦出血ICH模型，觀察重組人紅細(xì)胞生成素（rhEPO）對大鼠腦ICH模型治療后，對神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達(dá)的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

重組人促紅細(xì)胞生成素購自上海索寶生物科技有限公司；實(shí)時熒光定量PCR儀-7500購自美國Thermo Fisher公司；電泳設(shè)備購自Major Science；多克隆Caspase3、JAK2、STAT5一抗購自美國abcam試劑公司；堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自上海安馳生物科技有限公司； DAB顯色試劑盒和TUNEL凋亡試驗(yàn)盒購自上海索寶生物科技有限公司；蛋白濃度測定使用BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物與分組處理

8周齡SPF級雄性Wistar大鼠30只（購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司）。大鼠飼養(yǎng)在SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，溫度為（22±2）℃， 12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。大鼠構(gòu)建腦出血ICH模型后隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、ICH模型組和rhEPO組，每組10只。

1.3方法

1.3.1 ICH模型的制備 腹腔注射10%的水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠，將大鼠固定于腦立體定位儀上，消毒切開頭皮，微量注射儀取大鼠自體不凝血50 μl，而后勻速緩慢2～3 min注入右側(cè)大鼠尾狀核部位，留針10 min再緩慢拔出，縫合切口。治療組術(shù)后腹腔注射rhEPO（3000 IU/kg），假手術(shù)組步驟同上，僅不注射血。假手術(shù)組與ICH模型組術(shù)后腹腔注射0.5 ml生理鹽水。

1.3.2腦標(biāo)本采集與組織切片制備 大鼠用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，依次用4℃生理鹽水400 ml，4%多聚甲醛400 ml進(jìn)行心臟灌注。取腦后用4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋，制備厚度為5 μm的石蠟切片，分別用于免疫組織化學(xué)染色及TUNEL凋亡檢測。

1.3.3神經(jīng)功能評分 手術(shù)后功能缺損按 Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。0分：無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分：不能完全伸展左前肢；2分：向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時向左側(cè)傾倒；4分：不能自行行走， 有意識障礙。ICH造模后24 h檢測動物的神經(jīng)功能評分。

1.3.4 TUNEL原位凋亡細(xì)胞檢測 3%濃度 H2O2室溫孵育石蠟切片10 min，37℃下用蛋白酶K消化10 min。37℃加入標(biāo)記液孵育2 h，室溫加封閉液孵育30 min。加入生物素化抗地高辛抗體室溫孵育30 min，SABC試劑加入其中恒溫37℃反應(yīng)30 min，DAB顯色液加入其中進(jìn)行顯色，用顯微鏡進(jìn)行觀察。凋亡陽性細(xì)胞為細(xì)胞核含有棕黃色顆粒者，每張切片計數(shù)5個視野，計算切片凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測Caspase3表達(dá) PBS洗滌切片3次，室溫下滴入血清進(jìn)行封閉30 min，而后濾紙吸取殘留的血清，加入一抗Caspase3（1∶500）孵育過夜，隔夜復(fù)溫45 min，PBS洗滌3次，二抗（1∶1000）孵育30 min，PBS洗滌三次，加入SP室溫反應(yīng)30 min，加入DAB顯色液。顯微鏡觀察。細(xì)胞核中含有棕黃色顆粒為陽性，取5個視野，計算切片中的表達(dá)Caspase3的陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.3.6 Western blot檢測磷酸化JAK2、STAT5的表達(dá)量 按照100∶1的比例混合裂解液與PMSF，裂解液裂解大腦組織后，低溫離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，調(diào)整各組的蛋白總量為30 μg/μl。取各組樣品加入電泳槽中進(jìn)行電泳，基層膠20 min、80V，分離膠60 min、120 V，按蛋白分子量大小切膠，轉(zhuǎn)膜，用BSA封閉PVDF膜1 h，加入一抗（1∶500），4℃孵育過夜，隔夜室溫下用TBST洗膜3次，加入二抗（1∶1000），孵育1 h，用TBST洗膜3次，加入顯色液進(jìn)行顯色3 min，用Quantity-one軟件以及Bio-Pro凝膠成像分析儀成像對各條帶進(jìn)行灰度掃描從而得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.3.7 Real-Time PCR檢測大鼠JAK2、STAT5 mRNA表達(dá)含量 用Trizol提取中腦組織RNA，用Prime ScriptRRT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA （購自TaKaRa公司），用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行Real-time PCR操作（購自TaKaRa），其引物序列為：JAK2——F：5′-GCTCCTCTCCTTGACGACTTT-3′，R：5′-ACCTTATCCGCTTCCGAGTTA-3′；STAT5——F：5′-GGGC-ATCACCATTGCTTGGAAG-3′，R：5′-GGAGCTTCTGGCAGAAGTGAAG-3′；Β-ACTIN——F：5′-TGGGT-CAGAAGGACTCCTATG-3′，R：5′-CAGGCAGCTCATA-GCTCTTCT-3′。

PCR反應(yīng)獲得閾值循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT），而后采取CT值比較法，即利用起始cDNA濃度的對數(shù)與CT值成反比關(guān)系，從而計算出不同樣本之間的相對百分?jǐn)?shù)。公式為 ΔΔCT=（CT.實(shí)驗(yàn)組目的基因-CT.實(shí)驗(yàn)組管家基因）-（CT.對照組目的基因-CT.對照組管家基因）。目的基因的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 13.0進(jìn)行處理，計量資料用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組的神經(jīng)功能評分

如表1所示，手術(shù)建立腦出血模型后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分。按 Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)判定，ICH 模型組4只評價為1分，3只評價為2分，2只評價為3分；rhEPO組治療后，5只評價為1分，2只評價為2分，1只評價為3分，說明rhEPO可以改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷，恢復(fù)神經(jīng)功能。

2.2 TUNEL凋亡檢測結(jié)果

如圖1所示，假手術(shù)組僅僅見到極少量凋亡細(xì)胞，ICH模型組和rhEPO組凋亡細(xì)胞明顯增多。圖2表示TUNEL原位凋亡細(xì)胞檢測凋亡細(xì)胞數(shù)的變化，與假手術(shù)組相比，ICH模型組和rhEPO組中凋亡細(xì)胞明顯增多（P<0.05）；與ICH模型組相比，rhEPO組中凋亡細(xì)胞明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Caspase3免疫組織化學(xué)結(jié)果

由圖3可知，假手術(shù)組、ICH模型組和rhEPO組的Caspase3蛋白的染色強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。如圖4，免疫組織化學(xué)的光密度結(jié)果分析顯示，ICH模型組和rhEPO組中的Caspase3蛋白表達(dá)含量均比假手術(shù)組中的蛋白表達(dá)有顯著增加（P<0.05）。與ICH模型組中的Caspase3蛋白表達(dá)含量相比，rhEPO組中的Caspase3表達(dá)含量顯著降低（P<0.05）。

2.4 JAK2、STAT5蛋白表達(dá)水平

如圖5，與假手術(shù)組相比，ICH模型組和rhEPO組中JAK2、STAT5的蛋白表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與ICH模型組相比，rhEPO組中的JAK2、STAT5蛋白表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明rhEPO組可以調(diào)節(jié)JAK2/STAT5信號通路的蛋白水平改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷。

2.5 JAK2、STAT5 mRNA表達(dá)水平

如圖6，與假手術(shù)組相比，ICH模型組和rhEPO組中JAK2、STAT5的mRNA表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與ICH模型組相比，rhEPO組中的JAK2、STAT5 mRNA表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明rhEPO組可以調(diào)節(jié)JAK2/STAT5信號通路的基因水平來緩解大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷。

3 討論

隨著人群年齡的增長，腦出血的發(fā)生率顯著升高，致殘致死率高[6]。腦出血后原發(fā)性的腦損傷主要是由于腦血腫對于鄰近腦組織的損傷，腦出血后繼發(fā)性的損傷也是腦出血后病人神經(jīng)功能的損傷的重要原因[7]。繼發(fā)性的腦損傷原因包括細(xì)胞死亡、腦水腫、血腦屏障的破壞，相關(guān)機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡后釋放的物質(zhì)、酶活性的抑制等[8]。腦出血后各種酶的變化也會導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[7，9-10]，因此，抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞是治療腦血管病的重要基礎(chǔ)。EPO是一種存在于人體內(nèi)的一種糖蛋白，具有提高造血的功能。最近研究表明，EPO可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)再生以及抑制細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞生存率[11]。之前有報道稱，EPO可以通過磷酸化激活A(yù)KT促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活。有研究表明，EPO及促紅細(xì)胞生成素受體在腦組織中均有表達(dá)[12]，并且rhEPO預(yù)處理對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，EPO具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[13-14]。作為一個最新的保護(hù)因子，其保護(hù)作用及其機(jī)制引起大量的研究。但是EPO在腦出血中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究較少[15]。

腦出血之后血腫周圍的細(xì)胞會出現(xiàn)凋亡[16]。其中信號通路是多種細(xì)胞因子和生長因子等的共同通路[17]，應(yīng)激反應(yīng)時，JAK2/STAT5 的信號傳導(dǎo)可以與胞膜上的 JAK 結(jié)合位點(diǎn)，并促使 STAT磷酸化，完成與目的基因的信號傳導(dǎo)和表達(dá)調(diào)控[18]。JAK-STAT在細(xì)胞的凋亡、分化、增殖以及各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用[19-20]。

本研究結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞數(shù)和Caspase3的蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)在ICH模型組和rhEPO組中顯著增多，說明在ICH模型組和rhEPO組中，腦出血模型建立成功，并且神經(jīng)元損傷較多，細(xì)胞凋亡發(fā)生明顯。但與ICH模型組相比，rhEPO組中凋亡細(xì)胞和Caspase3的蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，說明rhEPO具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡的作用。ICH模型組和rhEPO組中JAK2、STAT5的蛋白和mRNA表達(dá)量顯著增高，說明腦出血過程中JAK2/STAT5信號通路參與了神經(jīng)損傷過程；而與ICH模型組相比，rhEPO組中的JAK2、STAT5蛋白和mRNA表達(dá)量顯著下降，說明rhEPO組可以調(diào)節(jié)JAK2/STAT5信號通路的蛋白和mRNA水平改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明JAK2、STAT5的顯著性表達(dá)參與了腦出血ICH發(fā)生的重要階段，可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。而rhEPO可以通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT5信號通路來緩解神經(jīng)細(xì)胞損傷，在神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)抗凋亡過程中起重要作用。

綜上所述，rhEPO的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能是JAK2/STAT5信號機(jī)制通路所介導(dǎo)的抗凋亡的作用。研究rhEPO在腦出血發(fā)生后產(chǎn)生保護(hù)作用的具體機(jī)制，對減少腦出血后減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)有著重要意義，可以為臨床治療提供有效的幫助。

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（收稿日期：2017-03-17 本文編輯：許俊琴）