快速PCR方法在哈蟆油真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用研究

何志一+唐先明+劉建輝+袁媛+蔣超+趙玉洋+王洋

[摘要] 該研究依據(jù)哈蟆油Cyt b基因155位SNP位點(diǎn)設(shè)計位點(diǎn)特異性PCR引物，采用堿裂解法提取基因組DNA，2步循環(huán) PCR 程序進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，并對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而建立起一種哈蟆油及其4種常見混偽品的快速PCR鑒別方法。該方法在90 ℃變性3 s，62 ℃退火延伸20 s進(jìn)行32個循環(huán)時，加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ染料，正品顯示出明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。該方法準(zhǔn)確、簡便，40 min內(nèi)即可完成鑒別，為哈蟆油藥材現(xiàn)場快速鑒定提供技術(shù)支持。

[關(guān)鍵詞] 快速PCR；哈蟆油；分子鑒定；熒光檢測

[Abstract] Rapid allele-specific PCR primer was designed base on Cytb 155 A/T single nucleotide polymorphism， DNA was extracted by alkaline lysis and the PCR reaction systems including denatured and annealing temperature and cycle numbers were optimized. The results were performed to authenticate Ranae Oviductus and its 4 adulterants. When 100×SYBR Green I was added in the PCR product at 90 ℃ denatured 3 s， 62 ℃ annealing 20 s and 32 cycle. Ranae Oviductus visualized strong green fluorescence under 365 nm UV lamp whereas adulterants appeared negative. The whole process can be completed in 40 minutes.The established method provides the technical support for authentication of the Ranae Oviductus.

[Key words] rapid PCR；Ranae Oviductus；molecular authentication

哈蟆油Ranae Oviductus為蛙科動物中國林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得。具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤肺的功效，用于病后體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗，癆嗽咳血[1]。是一種集食用藥用于一身的名貴中藥材。由于多方面原因?qū)е鹿∮蛧?yán)重的供不應(yīng)求，致使偽品充斥于市。目前市場上的偽品哈蟆油主要有黑龍江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油 4類，其他偽品類型少見[2-3]。2015年版《中國藥典》規(guī)定哈蟆油的鑒別方法為性狀鑒定、高效液相色譜法鑒定及膨脹度測定法，但這些方法易受人為因素、環(huán)境條件或藥材本身的限制，實(shí)踐中哈蟆油的鑒定仍感到十分困難。

隨著分子生藥學(xué)的發(fā)展，分子鑒定技術(shù)在哈蟆油藥材的鑒別中得到不斷的應(yīng)用[3-6]，很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒別方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鑒別方法，從模板的提取、PCR 反應(yīng)到最終結(jié)果分析，單個樣品的鑒定步驟繁瑣，耗時長，且需要電泳檢測或序列分析比對，不利于現(xiàn)場快速鑒別的使用。

近年來，快速PCR方法已成功用于金銀花[7]，蛇類[8]，太子參[9]，人參、西洋參[10]等中藥材的真?zhèn)舞b別，因此本項(xiàng)研究基于快速PCR方法對哈蟆油及其常見混偽品（黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油）進(jìn)行鑒別研究，有效的提高哈蟆油鑒別反應(yīng)效率，為哈蟆油藥材的鑒別提供更加符合實(shí)際需要、簡便快捷的方法。

1 材料與儀器

1.1 藥材 收集不同產(chǎn)地中國林蛙10批、黑龍江林蛙4批、黑斑蛙4批、中華大蟾蜍4批、牛蛙2批，哈蟆油3批，牛蛙油1批。所有基原動物按傳統(tǒng)加工方法分別制成哈蟆油、黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另選取哈蟆油藥材3批進(jìn)行快速PCR方法研究。樣品分別采自吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、山東、江蘇、湖南、四川等地。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，見表1。

1.2 儀器 S1000型梯度PCR儀（Bio-rad公司）；ETC811型PCR儀（東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司）；22R型高速冷凍微量離心機(jī)（Beckman公司）；ZH-2型漩渦震蕩器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；MM400型球磨機(jī)（Retsch公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；310型凝膠成像系統(tǒng)（UVP公司），2000C型分光光度計（NanoDrop公司）。

1.3 試劑 瓊脂糖（西班牙 Biowest Agarose）；GelRed購自 Biotium 公司；SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、DL 2000 DNAMarker 購自 TaKaRa 公司；Transfast Taq DNA 聚合酶購自Transgen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶購自 Vazyme公司；SYBR Green Ⅰ購自 Invitrogen 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 基因組DNA提取及檢測 稱取10 mg研磨好的藥材粉末，使用堿裂解法[11]提取總DNA，采用10%的Chelex-100進(jìn)行純化，并用超微量分光光度計檢測DNA的濃度及純度。取不同樣品DNA，分別將濃度稀釋為20 mg·L^-1用于PCR反應(yīng)。選擇通用引物mcb398，mcb869[12]對哈蟆油及其混偽品樣品進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列及擴(kuò)增程序見表2。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。

2.2 基于Cyt b序列的哈蟆油位點(diǎn)特異性鑒別引物設(shè)計 從GenBank中下載得到中國林蛙、黑龍江林蛙、黑斑蛙、中華大蟾蜍、牛蛙Cytb序列。測序所得序列使用軟件CodonCode Aligner校對拼接，去除引物區(qū)，將下載和測序獲得序列使用BioEdit軟件進(jìn)行比對，篩選出哈蟆油基原物種中國林蛙特有的變異位點(diǎn)，根據(jù)變異位點(diǎn)使用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，在引物3′末端倒數(shù)第二位引入人為錯配。設(shè)計出2對鑒別引物，分別命名為155S-F/155S-R（擴(kuò)增片段約為530 bp），698S-F/698S-R（擴(kuò)增片段約為105 bp），由Invitrogen 公司合成，序列見表2。

2.3 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 根據(jù)引物的Tm及產(chǎn)物長度設(shè)置PCR反應(yīng)的初始反應(yīng)條件。取不同樣品DNA用于確定快速PCR反應(yīng)條件。PCR 反應(yīng)在 S1000 型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系和初始反應(yīng)程序見表2。反應(yīng)結(jié)束后取PCR 反應(yīng)產(chǎn)物6 μL，加入 2 μL 6×Loading buffer 混勻后于GelRed染色的 1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

利用哈蟆油SNP鑒別引物進(jìn)行快速位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)，并依次考察退火溫度：65，64，62，61，60 ℃；循環(huán)數(shù)：35，32，30，28個循環(huán)；變性溫度：95，90，88，86 ℃；變性時間： 5，3，1 s；退火延伸時間：20，18，16，10 s；引物終濃度：0.1，0.15，0.25 μmol·L^-1；dNTP終濃度：125，200 μmol·L^-1；哈蟆油模板DNA用量：10，20，40，60 ng；Taq酶種類：rTaq DNA 聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶，Transfast Taq DNA 聚合酶；不同PCR儀：S1000型PCR 儀 （Bio-rad公司），ETC811型PCR儀（東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司），對PCR 反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。

2.4 PCR產(chǎn)物檢測 在PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 2 μL 100 × SYBR Green Ⅰ，并于365 nm 紫外波長下進(jìn)行檢測，出現(xiàn)綠色熒光為陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。

3 結(jié)果與分析

3.1 模板DNA提取質(zhì)量 由于堿裂解法提取的 DNA 無法通過凝膠電泳檢測[13]，本文使用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測所獲得 DNA 質(zhì)量。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，利用mcb398，mcb869引物，正品哈蟆油藥材及其混淆品均獲得約 500 bp 大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖 1，表明提取的DNA 可以滿足PCR 反應(yīng)的要求。

3.2 鑒別引物的設(shè)計及驗(yàn)證 按照2.2設(shè)計的2對位點(diǎn)特異性鑒別引物中，155S-F/155S-R的PCR擴(kuò)增特異性較698S-F/698S-R引物好，故本研究選取155S-F/155S-R作為哈蟆油及其偽品的鑒別引物，結(jié)果見圖2。

3.3 快速PCR反應(yīng)條件的確定 在位點(diǎn)特異性PCR引物設(shè)計中人為的引入了錯配位點(diǎn)，因此要求

嚴(yán)格的反應(yīng)條件，兼顧快速PCR的擴(kuò)增效率，本文采用兩步法，30個循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上依次對退火溫度、循環(huán)數(shù)、變性溫度、變性時間、退火時間、引物用量、dNTP用量、模板用量進(jìn)行考察。結(jié)果顯示：①在退火溫度60～64 ℃，哈蟆油擴(kuò)增條帶隨溫度的升高逐漸減弱，在62 ℃時目的條帶亮度較強(qiáng)，混偽品未檢出條帶，熒光檢測結(jié)果與電泳結(jié)果一致，故本研究選擇62 ℃作為退火延伸溫度。②當(dāng)循環(huán)數(shù)≥30時，哈蟆油樣品可以得到目的條帶，但是循環(huán)數(shù)為30時，熒光檢測結(jié)果不明顯，兼顧擴(kuò)增產(chǎn)量與反應(yīng)時間，故本文選擇32次循環(huán)。③當(dāng)變性溫度≥88 ℃時，可以得到目的條帶，隨著變性溫度的降低，PCR成功率隨著降低，但是88 ℃時條帶弱，故選擇90 ℃作為變性溫度。④變性時間為3 s 時仍然可以進(jìn)行有效擴(kuò)增，故選擇3 s作為變性時間。⑤退火延伸時間對擴(kuò)增成功率有著重要影響，退火時間超過18 s時才能獲得有效的擴(kuò)增，因此次選擇20 s為退火時間。⑥當(dāng)引物終濃度在0.1～0.25 μmol·L^-1時，哈蟆油樣品有目的條帶，但是隨著引物用量的提高，正品與混偽品的熒光檢測結(jié)果區(qū)別越不明顯，這可能是生成了引物二聚體，影響到熒光檢測結(jié)果，故本文選擇其用量為0.1 μmol·L^-1。⑦當(dāng)dNTP終濃度為125 μmol·L^-1時，能夠擴(kuò)增出明亮的條帶，隨著其用量的增加條帶逐漸變?nèi)酰虼藢⑵溆昧慷?25 μmol·L^-1，引物和dNTP用量均不宜太高，這與學(xué)者報道相符[14]。⑧當(dāng)模板用量10～60 ng時，均只有哈蟆油樣品擴(kuò)增出單一的目的條帶，熒光檢測結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

綜合以上優(yōu)化結(jié)果，確定哈蟆油快速PCR鑒別方法為：PCR反應(yīng)體系為20 μL：2.0 μL 10×buffer，1.0 μL dNTPs（2.5 mmol·L^-1），0.2 μL 上游及下游引物（10 μmol ·L^-1），0.1 μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1 μL（約20 ng）模板 DNA，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為90 ℃ 3 s，62 ℃ 20 s，32 個循環(huán)。

采用以上反應(yīng)條件分別使用4種快速DNA聚合酶，其中SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶均能實(shí)現(xiàn)對哈蟆油的真?zhèn)舞b別，rTaq DNA 聚合酶、Transfast Taq DNA 聚合酶未能得到有效擴(kuò)增。使用不同廠家型號的PCR儀對哈蟆油及同屬近緣種樣品進(jìn)行快速 PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明：S1000型PCR 儀 （Bio-rad公司），ETC811型PCR儀（東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司），電泳檢測后均可獲得樣品的特異性目的條帶，反應(yīng)條件優(yōu)化見表3。

3.4 快速PCR反應(yīng)的熒光檢測 選擇優(yōu)化的哈蟆油快速 PCR反應(yīng)參數(shù)，對不同產(chǎn)地的哈蟆油及其混偽品樣品進(jìn)行快速 PCR 擴(kuò)增，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 2 μL 100 × SYBR Green Ⅰ，于 365 nm 紫外波長下進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果表明，哈蟆油樣品均顯示出明亮綠色熒光，而偽品不發(fā)出熒光，取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，哈蟆油正品均擴(kuò)增出目的條帶，混偽品均無條帶，見圖3。

4 討論

動物藥材作為中藥材的重要組成部分，被廣泛應(yīng)用于臨床，具有療效確切、經(jīng)濟(jì)價值高等特點(diǎn)，對其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要。傳統(tǒng)的性狀、理化鑒別需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員，且動物藥鑒定和分類學(xué)的專業(yè)人員較少，難免存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性差等缺陷等問題[15]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子鑒定技術(shù)已成為中藥材傳統(tǒng)鑒別方法的有益補(bǔ)充。

有關(guān)哈蟆油的PCR鑒別方法已有報道，但是由于哈蟆油藥材本身遇水膨脹，給哈蟆油的DNA提取帶來一定的困難，提取過程復(fù)雜，成功率低，已建立的PCR方法操作復(fù)雜，耗時長，這些因素制約了該方法的深入應(yīng)用。堿裂解法適用于中藥材DNA的快速提取，需要樣品量少，提取試劑簡單，操作簡便，5 min即可完成DNA提取，快速PCR技術(shù)可以在確保PCR反應(yīng)靈敏度和特異性的前提下盡可能縮短PCR時間、提高檢測效率[16]。采用堿裂解法進(jìn)行DNA提取，快速PCR進(jìn)行哈蟆油鑒別較經(jīng)典PCR鑒別方法具有準(zhǔn)確、快速、簡便等優(yōu)勢。

本項(xiàng)研究采用堿裂解法成功提取各樣品的基因組DNA，但DNA純度不高，為了得到滿足于后續(xù)試驗(yàn)要求的模板DNA，本研究使用Chelex-100對堿裂解提取得到DNA進(jìn)行了純化，提高了DNA純度與PCR擴(kuò)增效率，為后續(xù)快速PCR方法的建立奠定了基礎(chǔ)。通過對位點(diǎn)特異性 PCR 進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)合DNA快速提取與熒光檢測技術(shù)，建立了一種哈蟆油的快速PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了在 40 min 內(nèi)簡單、快速、直觀的鑒別哈蟆油及其常見混偽品的目的。該方法對鑒別人員的專業(yè)及儀器要求不高，實(shí)用性強(qiáng)，有助于實(shí)現(xiàn)哈蟆油藥材現(xiàn)場、準(zhǔn)確、快速鑒定的推廣與應(yīng)用。本研究對哈蟆油最常見的4種蛙類混偽品進(jìn)行了鑒別研究，對于哈蟆油非蛙類的偽品如：鱈魚精巢及瓊脂蛋白胨、馬鈴薯加工品沒有涉及，因此本研究所建立方法對非蛙類偽品的適用性有待于進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]