極端沙漠干燥炎熱環(huán)境土壤中耐熱和耐輻射菌的分離、培養(yǎng)與鑒定*

張曉波陳鑫源焦 雷 劉 毅肖 霞伊法爾·艾合買江 迪麗達爾·庫德熱提 孫玉萍

（1新疆醫(yī)科大學研究生學院 新疆烏魯木齊 830011 2新疆醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院 新疆烏魯木齊 830011 3新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 新疆烏魯木齊 830011）

新疆氣候類型為暖溫帶大陸性極干旱氣候，庫姆塔格沙漠位于塔里木盆地的東部，自然條件惡劣，氣候極端且干旱，屬于明顯的極端干旱多風氣候，這里白天高溫、低濕，夜晚溫度低，是典型的極端環(huán)境，這里必然生存著一些極端微生物種群，且尚處于未開墾階段，因此，這將可能是發(fā)現新的具有特殊功能微生物資源的寶藏。庫姆塔格沙漠地區(qū)干旱、高溫、輻射程度高，不適宜生物生長，若分離得到能耐干旱高溫和耐輻射的微生物，對今后研究沙漠環(huán)境微生物的生態(tài)作用，開發(fā)極端微生物資源，改善環(huán)境都具有一定的意義，同時這些耐高溫、耐輻射微生物還可以應用于工業(yè)生產和醫(yī)藥衛(wèi)生實踐中。本研究目的是從庫姆塔格沙漠干燥炎熱極端沙漠土壤中分離培養(yǎng)、馴化和鑒定耐高溫耐紫外線微生物，為后續(xù)耐熱和輻射機制研究提供基礎資料并為耐高熱、耐輻射菌株的功能研究提供菌株資源儲備。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和保存 實驗樣品為沙漠土壤樣品，采集自新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番盆地鄯善縣庫木塔格沙漠（北緯 24°50′11″，東經 90°12′30″，海拔 440 m），取樣深度約 10 cm，取樣約 500 g，樣品存放無菌瓶中，4℃保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 LB牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，LB肉湯培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，均購自青島日水生物技術有限公司。

1.3 干旱沙漠土壤耐高溫耐輻射菌的馴化培養(yǎng)

1.3.1 確定稀釋涂布的合適稀釋梯度范圍 將加有適量玻璃珠和90 mL生理鹽水的250 mL三角瓶滅菌，稱取10．0 g土壤樣品于錐形瓶中，震蕩制成稀釋度為10-1的土壤樣品懸液，從懸液中吸取1 mL于裝有9 mL生理鹽水的試管中，震蕩均勻，得10-2的稀釋液。依照此方法，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-76 個稀釋度的溶液，取 100 μL涂平板，分別紫外照射 2 min、5 min、10 min，每個稀釋度做3個重復，于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察平板上單菌落生長情況，直至單茵落數量不再增加。確定紫外照射5 min的10-4、10-52個稀釋度的單菌落生長數量情況較為理想。

1.3.2 稀釋涂布平板法處理樣品 樣品的稀釋處理步驟如 1.3.1所示，進行 10-3、10-4、10-53個稀釋度稀釋，將3個稀釋度各做3個重復涂布，紫外燈照射5 min，于50℃ 恒溫倒置培養(yǎng)2~3 d。觀察單菌落數量變化。

1.3.3 菌株的純化和觀察 挑取稀釋涂布平板上的單菌落，進行分區(qū)劃線純化，純化3次以后，挑取平板上的單菌落進行形態(tài)學的觀察（內容包括菌落顏色、形狀、光澤度、潮濕度、凸起或凹陷等立體形態(tài)、是否透明、邊緣是否整齊等）。利用LB培養(yǎng)基平板劃線純化菌株。純化好的菌株，利用革蘭氏染色，并于光學顯微鏡下觀察菌體（染色后顏色、形態(tài)）。利用LB肉湯培養(yǎng)基已純化菌株進行擴大培養(yǎng)后，放入4℃冰箱內保藏。

1.4 耐高溫耐輻射菌基因組DNA提取及16S rDNA片段PCR擴增 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組總DNA，并以其為模板，采用細菌通用引物 Eubac 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 Eubac 1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對純菌的 16S rDNA序列進行擴增［13］。 PCR 反應體系為:模板 10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L） 4 μL、模板 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL，補充去離子水至 50 μL。反應條件：94℃ 5 min；94℃ 50 s、55℃ 50 s、72℃ 50 s、33個循環(huán)、72℃ 7 min。PCR產物送上海生工測序，NCBI Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab）網站數據比較已知序列，鑒定已純化菌株。

2 結果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)學觀察 高溫輻射（50℃，紫外照射5 min）條件下培養(yǎng)共得到形態(tài)染色不同的耐高溫、耐輻射的9菌株，形態(tài)描述見表1。

表1 分離培養(yǎng)獲得耐高溫耐輻射菌株的形態(tài)描述

2.2 沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌16S rDNA測序及比對 對純化的9株菌進行16S rDNA測序并比對，共獲得4株純菌，均屬于芽孢桿菌，與最相似菌株相似度高達100%，見表2。

表2 沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌16S rDNA比對結果

2.3 沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌系統發(fā)育分析 用鄰接法構建系統進化樹（圖1）。

圖1 鄰接法構建的沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌16S rDNA序列系統發(fā)育樹

3 討論

極端環(huán)境是指大多數生物無法生存的，存在某些特有的物理化學條件，例如高溫、低濕、高酸、高堿、高鹽、高壓及高輻射的環(huán)境，生活在極端環(huán)境中的微生物群體即被稱為極端微生物（Extremophils）［1-2］。 極端微生物的研究因其具有重大科學意義和廣泛應用價值而得到了飛速發(fā)展［3－4］。極端環(huán)境的特殊理化因素形成了特殊的微生物種類及代謝途徑，這些微生物能夠對抗高溫、高壓、高輻射等不利環(huán)境并產生特殊的生物物質［5］。耐輻射微生物具有對電離輻射、UV輻射、DNA誘變劑和干燥環(huán)境的極端抗性，在多種自然環(huán)境中都能夠發(fā)現和分離耐輻射微生物，尤其在干旱及高輻射環(huán)境中發(fā)現較多［6］。例如耐輻射奇球菌（Deinococcus radioduransR1）在1956年首次由美國科學家Oregon等從輻射滅菌后變質的肉類罐頭中分離出來，對電離輻射、紫外線和其他DNA損傷劑具有極強抗性，是迄今為止地球最耐輻射損傷的生物之一，其他例如 Rubrobacter、Acinetobacter、Chroococcidiopsis、Hymenobacter、Kineococcus、Kocuria、Methylobacterium和Thermococcus菌屬中也有發(fā)現耐輻射細菌的報道［7］。這些耐輻射菌株除了具有UV和γ射線及許多DNA誘變劑具有一定抗性，還對干燥和過氧化物等有較強的抗性，文獻報道一些耐輻射菌還具有吸附重金屬離子和降解芳烴類物質的特性［8］。開發(fā)和研究這類微生物菌種資源，不僅對闡明DNA損傷修復分子機理，而且在環(huán)境保護和生物修復、人類健康，乃至地外空間的開發(fā)和利用等方面有著十分重要的意義［9－10］。

新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番盆地鄯善縣庫木塔格沙漠是典型的極端環(huán)境，干旱、高溫、晝夜溫差大等惡劣的環(huán)境條件并不適合大多數的微生物生長。本研究采集該地區(qū)北緯 24°50′11″，東經 90°12′30″，海拔440 m的土壤，采樣地點鮮有人類活動，因此可以不考慮人為因素對樣品中微生物的影響。我國其他主要沙漠的土壤微生物生物量平均數量級約為106［11-12］，本實驗結果發(fā)現庫姆塔格沙漠土壤微生物生物量數量級在105左右，相對其他地區(qū)微生物數量較少，分析原因可能是因為庫木塔格沙漠土壤微生物的數量本來就不豐富，此外，在培養(yǎng)過程中，紫外線照射可能殺死了一部分微生物，因此該沙漠樣品微生物生物量偏小。

本研究通過分離培養(yǎng)獲得的細菌并經過高溫和高輻射馴化獲得到的耐輻射、耐高溫細菌，經過序列測定發(fā)現他們分屬于枯草芽胞桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis）、地芽胞桿菌屬（Geobacillussp.）、芽胞桿菌屬（Bacillussp.）和熱噬淀粉（Bacillus thermoamylovorans），其中優(yōu)勢菌屬為Bacillus（91.91%），可見芽孢桿菌屬是庫木塔格沙漠土壤微生物群落中的優(yōu)勢屬，2013年許璐等在對庫木塔格沙漠微生物多樣性的調查中也認為芽孢桿菌屬是庫木塔格沙漠的優(yōu)勢菌［13］，在其他沙漠微生物調查中，芽孢桿菌屬在我國其他沙漠地區(qū)也被分離得到，如塔克拉姆干沙漠和毛烏素沙漠沙地分離出了大量芽孢桿菌屬的菌株。芽孢桿菌屬革蘭氏陽性的大桿菌（約4~10 μm），嚴格需氧或兼性厭氧的有莢膜的桿菌。該屬細菌的重要特性是具有較好的抗逆性，能夠產生耐高溫、耐干旱及抗紫外線的內生孢子，能夠耐受高溫、輻射、干旱，使其能更好地適應沙漠環(huán)境，在自然界中分布廣泛。

4 結論

本研究結果進一步證實了芽孢桿菌屬是新疆干旱沙漠土壤環(huán)境中的優(yōu)勢菌群；馴化獲得5種耐熱和耐輻射菌，不僅在今后沙漠環(huán)境微生物的研究中具有一定的參考意義，并為今后對其功能研究儲備菌種和微生物資源。此次分離菌株種類較為單一且數量較少，可能原因為：1）沙漠環(huán)境較為極端，微生物分布的種類和數量本身較少；2）本實驗所使用培養(yǎng)方法針對性不高，無法完全培養(yǎng)沙漠環(huán)境全部微生物。