課堂教學中瘧原蟲血涂片染色方法的改進*

溫硯子 張 平 黃建榮

（中山大學生命科學學院 廣東廣州 510275）

傳統上瘧原蟲的血涂片染色主要采用的是Giemsa染色法［1］。但Giemsa染色效果易受到染色液質量（包括染色液制備時間、染色液的來源、是否進行充分過濾等）、染色時間、沖洗時間等因素的影響［2-3］，穩定性較差。在教學過程中，學生的操作參差不齊，呈現的染色效果差異很大，直接影響后續的觀察，影響到教學質量的穩定。Diff-Quik染色法是世界衛生組織（WHO）推薦的一種快速染色方法［4］。主要是由以美藍和伊紅為基礎的Wright染色法改良而來，和Wright染色方法相比進一步縮短了染色時間。而傳統Giemsa染色液采用天青B和曙紅Y為基礎，2種染料在水溶液中易氧化形成沉淀。和Giemsa染色法相比，Diff-Quik染色時間更短，染液穩定無沉渣、染色背景清晰。基于這些優點，Diff-Quik染色法在國內外已經被廣泛應用于臨床檢測及動物實驗中，包括精子染色、血液染色、體液（體腔液和尿液）染色、穿刺細胞學標本染色、甲狀腺穿刺細胞學染色及非腫瘤病變的細胞結構觀察等［5-6］。本研究將比較Giemsa和Diff-Quik 2種染色方法對瘧原蟲血涂片染色后的效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1）由中山醫學院實驗動物中心提供的感染伯氏瘧原蟲（Plasmodium Berghei）的 BALB/C小鼠 2只（感染率約10%~20%）。

2）試劑：Giemsa 染液（Sigma，USA），Diff-Quik A/B 染液（Baso，中國），甲醇，清水，pH6.6 磷酸緩沖液。

3）器材：小鼠取血夾，剪刀，玻片，染色板，滴管，燒杯。

1.2 實驗方法

1）取感染瘧原蟲的BALB/C小鼠，剪尾末端，取適量的血于玻片上，制作血涂片，并將玻片進行標記。

2）甲醇固定，干燥后進行染色。

3）染色（采用2種不同染色方法）。

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①Giemsa染色法：將玻片血膜朝下放置于染色板上，滴加1×Giemsa染液與涂片上血膜接觸，染色30~40 min。

②Diff-Quik染色法：將Diff-Quik A染液滴加至玻片上，覆蓋血膜，染色30 s；用pH6.6的磷酸緩沖液沖洗多余的染液，稍甩干；將Diff-Quik B染液滴加至玻片上，覆蓋涂片上的血膜，染色30 s。

4）洗片。將染色后的玻片放入盛滿清水的燒杯中，隨后取出，待玻片自然干燥后在油鏡下進行觀察。

2 實驗結果及討論

1）經Giemsa染色的小鼠瘧原蟲血涂片，背景顏色較淡，紅細胞著色不深（圖1），在課堂教學中由于學生處理不當（例如過度洗脫染液），甚至出現紅細胞完全不著色的情況。這樣的染色效果讓學生無法準確統計小鼠瘧原蟲的感染率。同時，經Giemsa染色后的瘧原蟲細胞核、細胞質顏色分辨不明顯，特別是細胞質相對較小的環狀體，經Giemsa染色后不能明顯展現它的典型結構（圖1A），影響學生對瘧原蟲紅內期各形態做出正確判斷。

圖1 伯氏瘧原蟲血涂片不同染色方法比較（400×）

2）Giemsa染液殘渣較多，即使在對染液進行過濾處理，但在染色后的血涂片上仍不可避免地出現一些殘渣，干擾初學者對血涂片中原蟲的觀察和分析。

3）Giemsa染色法耗時長，需要 30~40 min，Diff-Quik染色法則只需要30 s。

Diff-Quick染色已經被證實能夠很好地反映細胞質細節［2，7］，Diff-Quik 染色后紅細胞及瘧原蟲的著色明顯，瘧原蟲的細胞核（紫紅色）和細胞質（藍色）容易區分，并且血涂片背景干凈、清晰。將Diff-Quik染色法應用于瘧原蟲血涂片染色的教學中，能確保教學順利進行，以達到教學目的，也為實現高質量的教學提供保障。

此外，甲醇固定干燥后應盡快進行染色，否則細胞脫水嚴重，影響染色效果。用Diff-Quik染液A染色后，需要用磷酸緩沖液清洗多余的染液。多次試驗效果顯示，需保證磷酸緩沖液的pH值為6.6，過堿溶液將會導致細胞質不著色。

Giemsa染色后的瘧原蟲血涂片保存時間較長，約2~3年［8］利用 Diff-Quik染色法獲得的玻片是否能進行長時間保存還需進一步證實。與Giemsa染色相比，瘧色素累積形成的瘧色粒經Diff-Quik染液染色后呈深藍色，不像Giemsa染色后表現出褐色，深藍色不易與細胞質分開。