林麝全基因組微衛星分布規律研究

盧婷， 王晨， 杜超， 劉姝， 沈詠梅， 張修月， 岳碧松*

(1. 四川大學生命科學學院，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都610064；2.四川省藥用動物工程技術研究中心，成都610081)

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林麝全基因組微衛星分布規律研究

盧婷1#， 王晨1#， 杜超1， 劉姝2， 沈詠梅2， 張修月1， 岳碧松1*

(1. 四川大學生命科學學院，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都610064；2.四川省藥用動物工程技術研究中心，成都610081)

林麝Moschusberezovskii是中國重要的資源動物，也是國家Ⅰ級重點保護野生動物。本研究使用生物信息學方法，分析林麝全基因組中完美型微衛星的分布特征。在林麝2.53 Gb的基因組序列中，共搜索到665 524個完美型微衛星，總長度為11 517 784 bp，占基因組序列總長度的0.42%，總豐度為244個/Mb。林麝基因組中，單堿基微衛星序列數量最多，為221 058個，約占總微衛星數的33.22%，豐度為81.05個/Mb，然后依次為二堿基、五堿基、三堿基、四堿基、六堿基重復類型微衛星。林麝基因組中數目最多的10種微衛星類別依次為：A、AACTG、AGC、AC、AT、AG、AAAT、AAC、AAT和AAAC，占所有基因組微衛星的93.2%，表現出明顯的A、T偏好。林麝基因組微衛星序列分布研究表明，其在外顯子(2 530個)上的分布數量遠低于內含子(200 906個)和基因間隔區(454 596個)，與前人關于微衛星在非編碼區的分布多于編碼區的結論一致。本研究為深入研究林麝基因組特征及篩選更多優良微衛星標記提供了基礎數據。

林麝；全基因組；微衛星；分布規律

微衛星序列由核心序列和側翼序列組成，其核心序列由l～6個核苷酸基序串聯重復構成(蔣雪梅等，2015)。微衛星廣泛分布于真核生物、原核生物和病毒的基因組中(Tautz，1989；李午佼等，2014)，除分布于基因組的非編碼區(如內含子和基因間隔區)外，也存在于編碼區(Ellegren，2004；Huangetal.，2015)。微衛星核心序列的重復數具有高可變性，使其在不同個體中有差異，并且同一位點在不同個體中存在多個等位基因(李玉芝，2012)，因而微衛星具有高度多態性。但微衛星的側翼序列相對保守，可以根據它的保守性設計引物，再通過PCR方法對基因組DNA進行擴增得到微衛星標記。微衛星不僅在基因組中分布廣泛、多態性高，而且還具有雜合子比率高、選擇中性、共顯性遺傳、分析方法簡單、實驗結果穩定等優點，被廣泛用于遺傳圖譜構建(Massaultetal.，2010)、親緣關系鑒定(Serbezovetal.，2010)、種群遺傳多樣性分析(戚文華等，2014)等研究。

林麝Moschusberezovskii隸屬于偶蹄目Cetartiodactyla麝科Moschidae麝屬Moschus。成體雄麝香腺囊分泌的麝香具有較高的經濟價值和藥用價值(Mengetal.，2006)，野外亂捕濫獵猖獗，加之其棲息地破壞，野生林麝已經瀕臨滅絕(王淯等，2006；Huangetal.，2013)。我國20世紀50年代開始人工飼養研究，取得了可喜成果，但存在管理粗放、近交退化、疾病多、繁殖力低等問題，阻礙了人工養麝業的正常發展(王淯等，2006；Sheng & Liu，2007；許珂等，2013)。本研究在完成林麝全基因組測序的基礎上，對微衛星序列特征和分布規律進行統計分析，對進一步篩選高質量的林麝微衛星分子標記和林麝分子遺傳學研究具有重要意義。

1 研究方法

1.1數據來源

林麝基因組大小為2.53 Gb，文件為FASTA格式，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司測序，本實驗室組裝和注釋。

1.2微衛星搜索

使用本實驗室開發的微衛星搜索統計軟件MSDBv2.4(Duetal.，2013)，從林麝基因組中掃描搜索微衛星序列。設置的統計標準如下：(1)重復次數，單堿基微衛星重復次數為12次及以上，二堿基和三堿基微衛星重復次數分別為7次和5次及以上，四、五、六堿基微衛星重復次數為4次及以上；(2)重復序列的側翼序列長度大于200 bp。

1.3微衛星定位

根據林麝基因組的注釋信息，使用本實驗室編寫的Python腳本對搜索到的微衛星序列進行定位，判斷微衛星在基因組的具體位置。

2 結果

2.1不同重復類型的微衛星的總體分布特征

在林麝2.53 Gb的基因組序列中搜索到完美型微衛星序列總數為665 524個；重復序列總長度為11 517 784 bp，占基因組序列總長度的0.42%；總豐度為244個/Mb。

不同重復類型微衛星的數量分布特征如表1所示：林麝基因組中，單堿基微衛星序列數量最多，為221 058個，約占微衛星總數的33.22%，豐度為81.05個/Mb；其次是二堿基微衛星，為144 258個，約占微衛星總數的21.68%，豐度為52.89個/Mb；六堿基微衛星數目最少，為567個，只占微衛星總數的0.09%，豐度為0.21個/Mb。

表1 微衛星各重復類型的數目、總長度、比例和豐度Table 1 The number， percent and abundance of microsatellites in different types of repeats

注： 重復類型中的Mono-， Di-， Tri-， Tetra-， Pentra-和Hexa-的后綴都是nucleotide。

Notes: The suffix of Mono-， Di-， Tri-， Tetra-， Pentra-and Hexa- is nucleotide.

2.2各重復類型微衛星核心序列重復次數分布

林麝基因組中，不同類型微衛星重復次數范圍有較大的差異。單堿基微衛星的重復次數主要分布在12～16次，數量占單堿基微衛星總數的88.90%，重復12次的數目高達65 000個，最高重復次數為733次；二堿基微衛星序列重復拷貝數主要分布在7～10次，數量占二堿基微衛星總數的77.69%，重復7次的二堿基微衛星最多，有51 305個，最高重復次數達1 560次；三堿基微衛星重復拷貝數主要分布在5～7次，占95.56%，重復5次的數量超過了三堿基微衛星總數一半，為67 308個，最高重復次數為175次；四堿基微衛星中，4次重復拷貝的微衛星數目最多，為3 224個，占所有四堿基微衛星總數的82.65%，最高重復次數為437次；五堿基微衛星數目最多的也是4次重復拷貝，達100 000個，占所有五堿基微衛星數量的73.22%，最高重復次數為111次；在總數只有567個的六堿基微衛星中，其重復拷貝數在4～26次，但重復4次的六堿基微衛星超過了450個，占六堿基微衛星總數的83.07%，最高重復次數為26次。6種重復類型微衛星的最高重復次數所對應的微衛星數量都為1個，且重復次數與微衛星數量表現出隨著重復次數的增加，微衛星數量逐漸減少的趨勢。

2.3含量豐富的微衛星類別

林麝基因組微衛星序列中，除了不同重復類型的微衛星數量差異明顯外，同種微衛星類型不同類別的數量也有很大差別(表2)。在單堿基和五堿基微衛星中，A和AACTG重復序列數量占絕對優勢，分別占同類微衛星數量的98.67%和95.46%；其余4種微衛星類型中最多的重復拷貝類別分別為：AC、AGC、AAAT和AACCCT。除六堿基微衛星外，單堿基至五堿基微衛星都表現出一種重復拷貝類別數量占明顯優勢的結果，如三堿基微衛星中，AGC重復類別數量為97 662個，占三堿基微衛星總數(120 319)的81.17%，遠超過剩下所有重復類別的總和。所有微衛星重復類別中，數目最多的10種依次為：A(32.77%)，AACTG(20.13%)，AGC(14.67%)，AC(14.00%)，AT(5.92%)，AG(1.70%)，AAAT(1.66%)，AAC(0.81%)，AAT(0.80%)和AAAC (0.72%)，有明顯的A、T偏好。這10種重復拷貝類別的數量都大于4 500個，占所有基因組微衛星總數的93.2%。

表2 二堿基至六堿基微衛星數目最多的重復拷貝類別Table 2 The most frequent microsatellite motifs in 2-6 repeats

2.4微衛星在基因組上的分布特征

林麝基因組微衛星在基因組上的定位結果表明，共有203 375個微衛星分布在基因上，在基因間區的有454 596個。對分布在基因上的微衛星進一步定位分析，結果如表3，有2 530個微衛星在外顯子上，占基因上微衛星總數的0.38%，包括1～6堿基微衛星個數分別為：27、19、2 363、22、16和83個。外顯子上三堿基微衛星數量最多，共由10種三堿基微衛星重復拷貝類別組成：CCG(702)，AGC(630)，AGG(398)，ACC(396)，ATC(107)，AAG(66)，AAC(33)，ACG(26)，AAT(3)和ACT(2)。除ATC與ACT對應的是終止密碼子外，其余8種都是氨基酸密碼子，它們所對應的氨基酸分別是：CCG-Gly，AGC-Ser，AGG-Ser，ACC-Trp，AAG-Phe，AAC-Leu，ACG-Cys和AAT-Leu。內含子上有200 906個微衛星，占基因上微衛星總數的30.53%，其數量遠多于外顯子微衛星的數量。內含子中最多的微衛星重復類型是單堿基微衛星，共有72 718個，占33.19%，其次是二堿基微衛星和三堿基微衛星。

3 討論

本研究以實驗室組裝的林麝基因組序列為基礎，利用生物信息學方法對林麝基因組中完美型微衛星序列進行搜索統計。微衛星序列含量分析表明，林麝的微衛星序列占基因組比例(0.42%)與哺乳綱Mammalia物種如牛Bostaurus(0.48%)、綿羊Ovisaries(0.48%)(戚文華等，2013)、牦牛Bosgrunniens(0.47 %)(Ma，2015)等物種基本一致，而低于大熊貓Ailuropodamelanoleuca(0.64%)、北極熊Ursusmaritimus(0.79%)(李午佼等，2014)、人類Homosapiens(3%)(Subramanianetal.，2003)和小鼠Musmusculus(2.85%)(童曉玲等，2006)。此結果與王月月等(2015)的研究一致，他們認為，親緣關系越近，物種基因組微衛星特征越相似。

表3 微衛星在基因內外的數量分布Table 3 Number， percentage， and relative abundanceof microsatellites in different regions

研究表明，不同物種基因組微衛星的數量、重復類型、密度等都存在很大差別(Websteretal.，2002；汪自立等，2013)。林麝基因組微衛星中單堿基微衛星數量占優勢(33.22%)，這與牛、綿羊(戚文華等，2013)、牦牛(Ma，2015)等物種基因組中優勢微衛星類型相同。在嚙齒類和節肢動物基因組中，二堿基微衛星數量占優勢，而酵母Saccharomycescerevisiae和絲狀真菌Neurosporacrassa(黃杰等，2012)等基因組中，三堿基微衛星占主導地位。

在林麝基因組微衛星中，6種堿基重復類型都表現出同種重復類型的微衛星隨著微衛星核心序列重復次數的增加，其對應的微衛星數量逐步減少的趨勢，如單堿基微衛星主要集中在重復12～16次，而最高重復數733次的單堿基微衛星只有1個，從而使單堿基微衛星序列的長度主要集中在12～16 bp。這個規律與Ellegren(2000)的研究相符，他們認為在基因座上，長等位基因傾向于變短，從而阻止微衛星長度的無限增長，因此微衛星序列的長度一般會維持在一定范圍內。這可能與微衛星的穩定性有關，隨著微衛星長度的增加，其穩定性會下降(Wierdletal.，1997)，而長微衛星數量不多可能是由于它們有下調的突變偏好且存在時間短(Harr & Schl?tterer，2000)。

微衛星在林麝基因組中的分布也有差異，其在外顯子(2 530個)上的分布數量遠低于非編碼區，如內含子(200 906個)和基因間隔區(454 596個)，此結果支持前人關于微衛星在非編碼區的分布多于編碼區的結論(Ellegren，2004)。外顯子所有微衛星序列中，三堿基微衛星數量最為豐富，占外顯子微衛星總數的93.40%，這可能是編碼區中非三堿基微衛星類型的突變會導致移碼突變，而生物的選擇作用將會減少這些非三堿基微衛星的固定，從而減少其含量(Metzgaretal.，2000；Doyleetal.，2013)。

微衛星作為遺傳標記的應用實踐表明，相對于二堿基、三堿基微衛星，四堿基微衛星位點在PCR過程中，不易出現滑帶(stutter bands)或陰影帶(shadow bands)，相對能產生更穩定、更精確的基因分型結果(Archieetal.，2003；Lietal.，2010)。然而，目前已公布的微衛星標記全部為二堿基微衛星(Zouetal.，2005；Xiaetal.，2006；Zhangetal.，2007；Zhaoetal.，2008)。根據林麝基因組四堿基微衛星序列分析結果，共搜索到四堿基微衛星38 989個，但絕大多集中在低重復次數(重復4次)，重復5次以上的很少，林麝四堿基微衛星數量有限，這是到目前為止分離篩選得到的高質量四堿基微衛星分子標記較少的重要原因。

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DistributionRegularityofMicrosatellitesinMoschusberezovskiiGenome

LU Ting1#， WANG Chen1#， DU Chao1， LIU Shu2， SHEN Yongmei2， ZHANG Xiuyue1， YUE Bisong1*

(1. Sichuan Key Laboratory of Conservation Biology on Endangered Wildlife， College of Life Sciences， Sichuan University，Chengdu 610064， China； 2. Sichuan Medicinal Animal Engineering Technology Research Center， Chengdu 610081， China)

Forest musk deer (Moschusberezovskii) is a critically endangered species. Perfect microsatellite number and distribution regularity of microsatellites in forest musk deer genome were analyzed by microsatellite search tool. A repertoire of 665 524 perfect SSRs with 1-6 bp nucleotide motifs accounting for 0.42% of forest musk deer genome (2.53 Gb) were scanned， and the abundance of microsatellites was 244 no./Mb. Mono-nucleotide was the most abundant category with the highest relative abundance (81.05 no./Mb)， accounting for 33.22% of all the SSRs， followed by di-nucleotide (21.68%)， pentra-nucleotide (21.09%)， tri-nucleotide (18.08%)， tetra-nucleotide (5.86%), and hexa-nucleotide (0.09%). The most abundant microsatellite repeats in forest musk deer genome were A， AACTG， AGC， AC， AT， AG， AAAT， AAC， AAT， and AAAC， totally accounting 93.2% of the scanned microsatellites and showed an apparent A and T preference. The number of microsatellites located on the coding sequences (n=2 530) was less than that on the non-coding sequence such as introns (n=200 906) and intergenic regions (n=454 596)， and this was consistent with previous studies. This study provides adequate material for the future study of forest musk deer.

Moschusberezovskii； genome； microsatellite； distribution regularities

2017-02-17接受日期：2017-04-26

四川省科技支撐計劃(2014NZ0107)

盧婷(1991—)， 女， 碩士研究生， 從事動物分子生物學研究， E-mail：619016141@qq.com#同等貢獻第一作者

*通信作者Corresponding author， E-mail：bsyue@scu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170044

Q959.8

： A

： 1000-7083(2017)04-0420-05