基于線粒體16SrRNA探討渤海海區矮擬帽貝的種群生態遺傳

史博洋， 李媛媛， 王儒曉， 曲江勇, 2*， 郭承華*， 劉傳林， 侯建海， 房輝， 劉楚童

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005； 2. 海南熱帶海洋學院，海南兩棲爬行動物研究重點實驗室，海南三亞572000)

?

基于線粒體16SrRNA探討渤海海區矮擬帽貝的種群生態遺傳

史博洋1， 李媛媛1， 王儒曉1， 曲江勇1, 2*， 郭承華1*， 劉傳林1， 侯建海1， 房輝1， 劉楚童1

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005； 2. 海南熱帶海洋學院，海南兩棲爬行動物研究重點實驗室，海南三亞572000)

采用聚合酶鏈式反應和直接測序的方法研究了渤海海區15個矮擬帽貝Patelloidapygmaea種群遺傳多樣性與環境因子的關系。180個個體的16S rRNA部分序列(615 bp)共發現264個多態性位點，153個轉換，114個顛換，界定32個單倍型。所有個體堿基含量依次為C(18.12%)、T(27.74%)、A(33.07%)、G(21.07%)；單倍型多樣性為0.835 1±0.019 1，核苷酸多樣性為0.449±0.214。矮擬帽貝大陸沿岸種群核苷酸多樣性(0.191 8±0.091 7)高于島嶼種群(0.107 3±0.081 6)。種群歷史動態結果顯示，矮擬帽貝經歷了種群近期擴張。與環境因子相關性研究發現，遺傳距離、序列變異、核苷酸多樣性與日照時數、日照百分率分別呈顯著正相關(P<0.05)；形態相關分析結果表明，變異主成分(殼長、殼寬)與年均降水量呈顯著負相關(P<0.05)；年均降水量、日照時數、日照百分率是影響矮擬帽貝形態變異、遺傳多樣性的主導因子，環境越穩定地區種群的遺傳多樣性越高。

矮擬帽貝； 16S rRNA； 生態遺傳； 遺傳多樣性

環境因子在物種的進化過程中發揮著重要作用，物種的分布、行為、生理和遺傳結構通常都會受到環境因子的影響，探究環境因子與生物多樣性的相關性是生態遺傳研究的重要內容之一(Scheiner，1993)。通常種群占據不同地理環境并呈現梯度性遺傳變化，這種結果主要受自然選擇與環境變遷影響(Jin & Liu，2008)，遺傳結構分化和自然環境變遷之間的相互作用是目前生態地理學關注的焦點。同類物種生活在不同環境下(溫度、降水、日照等)的地理種群遺傳多樣性存在地理變異，如荒漠沙蜥Phrynocephalusprzewalskii的遺傳多樣性與緯度、降水量顯著正相關，大石雞Alectorismagna、雉雞甘肅亞種Phasianuscolchicusstrauchi的遺傳多樣性與溫度呈顯著負相關，以及同種生物因環境而產生的形態改變影響基因頻率等(Michod，1981；Nevo，1981；曲江勇，劉迺發，2012)。環境對生物的影響(環境的演替、種群遺傳結構的多變)伴隨著表型與基因型的變化繼而改變種群結構，環境促進演替使種群遺傳分化趨于平衡穩定(Slatkin，1987)。

分子標記作為研究種群遺傳結構和地理分化的重要工具，目前已廣泛用于解決動物生態遺傳等問題(Wayne & Robert，2004)。動物線粒體DNA具有分子量小、進化速度快、結構簡單、表現為母系遺傳等特點，非常適于動物群體遺傳學和系統進化研究(Canapaetal.，2000)，其中16S rRNA基因進化速率適中，適合種群水平的遺傳多樣性及遺傳結構研究(Hondaetal.，2002)。

矮擬帽貝Patelloidapygmaea隸屬軟體動物門Mollusca腹足綱Gastropoda原始腹足目Archaeogastropoda笠貝科Acmaeidae(Surhoneetal.，2010)，中國習見種類，沿岸、島嶼均有分布。矮擬帽貝遍布整個潮間帶(海岸帶以上到淺層潮下帶)，棲息附著在大型水生植物、激浪區礁巖、珊瑚藻及其他貝殼等表面，主要攝食藻類與浮游植物(Lindberg，1990；Takenori & Takashi，1993；Kirkendale & Meyer，2004；Nakano & Ozawa，2007)。目前矮擬帽貝研究主要集中在系統學和分類學等領域，包括種水平鑒定、形態變異、遺傳多樣性等(Nakaietal.，2006；Gonzálezwevaretal.，2010)，種群系統地理研究較少。國內研究重點多為具有較大經濟價值的貝類，分布廣泛但無經濟價值的潮間帶貝類的系統地理格局受歷史因素、現今環境和生態因素的影響，其遺傳進化、系統地理分布格局未得到深入研究(Nietal.，2012)。

本研究以矮擬帽貝線粒體16S rRNA部分序列，探究矮擬帽貝的生態遺傳，揭示種群遺傳多樣性隨環境因子的變異規律，為中國矮擬帽貝種群遺傳研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1樣品采集、DNA提取及序列獲取

矮擬帽貝采樣點見圖1，大陸沿岸種群包括大連、莊河、營口、錦州、葫蘆島、秦皇島、萊州、蓬萊、煙臺；島嶼種群包括長島、砣磯島、大欽島、南隍城島、北隍城島。采集后測量個體的殼長、殼寬、殼高、殼周長、長斜邊、短斜邊、壁厚等；返回實驗室稱量殼干重、計算頭端角度與尾端角度(表1)，無水乙醇保存備用。

圖1 矮擬帽貝地理種群采集點Fig. 1 The sampling sites of Patelloida pygmaea in the Bohai Sea

DNA提取：DNeasy?組織&血液試劑盒(GTIN: 04053228006077，Lot：151046088，GIAGEN，德國)。PCR擴增：選用16S rRNA通用引物(華大基因合成)，16Sar-L：5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′；16SbrH：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′(Folmeretal.，1994)，PCR擴增反應體系(25 μL)：12.5 μL Taq MIX(0.625 U Taq酶、0.2 mmol·L-1dNTP、1.5 mmol·L-1MgCl2；Lot：A3701A，TaKaRa，中國大連)；0.15 μL (100 μM)上下游引物、1 μL DNA模板(80～100 ng)。PCR反應條件設置：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR結束后取4 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(1×TBE、5 V/cm恒壓、Goldenview染色)(瓊脂糖，Lot：142075，BIOWEST，西班牙；Goldenview，Lot：OHO9RL，濟南力戈科技有限公司)。PCR產物送北京六合華大公司進行ABI PRIMS 3730雙向測序。

1.2環境因子

選取經度、緯度、年均溫度、溫度變異系數、年均降水量、降水量變異系數、年均日照時數、日照率作為環境因子(表2)，從國家氣象數據共享服務網獲取10個地點近30年氣象數據，并計算氣溫、降水量變異系數(砣磯島、大欽島、小欽島、北隍城島、南隍城島等地區氣象站因缺少相關數據，未被國家氣象數據共享服務網收錄)。

1.3數據分析

雙向測序結果用Conting進行拼接，通過CLUSTAL_X 1.83進行序列比對，單倍型用DnaSP v5統計(Librado & Rozas，2009)。通過ARLEQUIN 3.5計算群體多樣性指數：單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣度(π)、序列平均核苷酸差異數(k)、擴張系數(Tau)、有效種群大小(θ)、種群分化系數(Fst)；AMOVA分析(Excoffier & Lischer，2010)；通過MEGA7計算遺傳距離(D)與序列變異(S)(Kumaretal.，2016)；樣品所測殼長、殼寬、殼高、殼周長、短斜邊、長斜邊、頭端角度、尾端角度、干重、壁厚等形態數據用平均數±標準差表示，形態變異采用主成分分析與相關性分析，以上統計分析均在SPSS 19.0(Arbuckle，2010)完成。

2 結果

2.1序列變異與遺傳多樣性

180個矮擬帽貝樣本的mtDNA 16S rRNA部分序列中，共發現了264個多態位點，堿基組成為C(18.12%)、T(27.74%)、A(33.07%)、G(21.07%)，轉換/顛換比為1.34(缺失位點少于5%)，界定32種單倍型。總體單倍型多樣性為0.835 1，核苷酸多樣性為0.449，核苷酸兩兩差異度為118.533。除莊河、蓬萊外，其他地理種群單倍型多樣性較高(表3)；大陸沿岸各種群的核苷酸多樣性、遺傳距離與序列變異整體高于島嶼種群，總體核苷酸多樣性差異較大(π大陸沿岸=0.197 8、π島嶼=0.107 3)，擴張系數與種群遺傳多樣性表明種群存在近期擴張(總體CI 95%：Tau=426.109、θ0=0、θ1=inf)；大陸沿岸種群與島嶼種群Fst=0.099(P<0.001)；AMOVA分析可知變異主要來自種群內(66.93%，P<0.001)(表4)。

表1 15個矮擬帽貝種群形態數據的平均數與標準差Table 1 Mean values and standard deviation of the morphological data of 15 Patelloida pygmaea populations

表2 10個矮擬帽貝地理種群近30年環境因子Table 2 Environmental factors of 10 Patelloida pygmaea populations in recent 30 years

表3 15個矮擬帽貝地理種群遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of 15 Patelloida pygmaea populations

表4 矮擬帽貝分子方差分析Table 4 AMOVA analysis of Patelloida pygmaea

表5 矮擬帽貝遺傳多樣性、形態與環境因子相關性分析Table 5 Relationship correlation of genetic diversity and morphology of Patelloida pygmaea with environmental factors

注Note:*P<0.05.

2.2遺傳多樣性與環境因子間的相關性

所有環境因子經正態分布檢驗，結果顯示均為正態分布，通過Person相關性檢驗(表5)，發現矮擬帽貝種群遺傳距離、序列變異、核苷酸多樣性與日照時數、日照百分率呈顯著正相關(P<0.05)；其他數據間無顯著相關性(P>0.05)。主成分分析顯示，殼長、殼寬為變異關鍵因子(貢獻值：74.6%、18.4%)，殼長、殼寬與環境因子相關性分析結果表明：殼長、殼寬與年均降水量呈顯著負相關(r=-0.703/-0.728，P=0.023/0.017)。

3 討論

對矮擬帽貝15個種群的線粒體16S rRNA基因序列研究表明，各地理種群較高的單倍型多樣性(0.486～1.000)和較低的核苷酸多樣性(0.001 6～0.185 5)，符合Grant和Bowen(1998)提出的海洋類生物較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性模式，該類型種群可能經歷過歷史擴張事件(Bowenetal.，2001)，Tau值與θ值也表明該物種存在近期歷史擴張；大陸沿岸種群與島嶼種群遺傳差異顯著，大陸沿岸種群遺傳多樣性整體高于島嶼種群，且分化顯著，暗示存在顯著的陸島遺傳模式，大陸沿岸種群更易擴張與進化，推測大陸沿岸種群更為古老，島嶼種群基因頻率受陸地基因流影響顯著(Finston & Peck，1995；曲若竹等，2004)。

氣候因子是影響生物進化的重要因子，其中溫度和降水量則是影響陸生動物進化的2個最重要生態因子，對外溫動物與內溫動物均具有顯著影響，且氣候對不同地區的同類物種的影響程度也不同。渤海不同地理種群矮擬帽貝遺傳結構研究結果表明，16S rRNA序列的遺傳距離、序列變異、核苷酸多樣性與日照時數、日照百分率呈顯著正相關，說明日照是影響矮擬帽貝遺傳多樣性的重要因素，日照時數越大，遺傳多樣性越高。溫度是影響貝類遺傳變異的關鍵環境因子(Kimetal.，2009)，海表溫度作為海水熱力狀況的物理量，受太陽輻射影響顯著(Joos & Spahni，2008)，推測矮擬帽貝作為潮間帶生物，棲息地以巖石海床為主，日照改變海面溫度繼而影響種群遺傳多樣性，且環境越不穩定，遺傳多樣性越低，與海洋無脊椎動物生態研究結果基本一致(Monarietal.，2007；Yuetal.，2009)。

形態變異主成分(殼長、殼寬)與環境因子相關性分析表明，降水量是影響形態變異的主要因素，與遺傳存在差異的主要原因是自然選擇導致物種基因遺傳與形態變異的模式不同，即選擇壓力對不同的類型作用不同(Correetal.，2002)。形態量度和其他環境因子的相關性趨勢與遺傳分析一致，說明表型通常是受基因控制和影響，自然選擇對表型作用實際上是作用于基因或基因型，即環境因素可以通過影響個體表型進而影響基因型頻率(Huangetal.，2007)。穩定環境中，較小的自然選擇壓力使不同的基因型被最大限度地保留，因此遺傳多樣性較高；在氣候不穩定區域，種群保留適應多變環境的基因型而在選擇壓力下淘汰其他基因型，遺傳多樣性會降低。

曲江勇, 劉迺發. 2012. 環境因子對雉雞甘肅亞種種群遺傳多樣性的影響[J]. 四川動物, 31(4): 518-523.

曲若竹, 侯林, 呂紅麗, 等. 2004. 群體遺傳結構中的基因流[J]. 遺傳, 26(3): 377-382.

Arbuckle JL. 2010. IBM SPSS Amos 19 user’s guide[M]. Chicago: Amos Development Corporation.

Bowen BW, Bass AL, Rocha LA,etal. 2001. Phylogeography of the trumpetfishes(Aulostomus): ring species complex on a global scale[J]. Evolution, 55(5): 1029-1039.

Canapa A, Barucca M, Caputo V,etal. 2000. A molecular analysis of the systematics of three Antarctic bivalves[J]. Bolletino di Zoologia, 67(sup1): 127-132.

Corre VL, Roux F, Reboud X. 2002. DNA polymorphism at the FRIGIDA gene inArabidopsisthaliana: extensive nonsynonymous variation is consistent with local selection for flowering time[J]. Molecular Biology & Evolution, 19(8): 1261-1271.

Excoffier L, Lischer HEL. 2010. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows[J]. Molecular Ecology Resources, 10(3): 564-567.

Finston TL, Peck SB. 1995. Population structure and gene flow in Stomion: a species swarm of flightless beetles of the Galápagos Islands[J]. Heredity An International Journal of Genetics, 75(4): 390-397.

Folmer O, Black M, Hoeh W,etal. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J]. Molecular Marine Biology & Biotechnology, 3(5): 294-299.

Gonzálezwevar CA, Nakano T, Caete JI,etal. 2010. Molecular phylogeny and historical biogeography ofNacella(Patellogastropoda: Nacellidae) in the Southern Ocean[J]. Molecular Phylogenetics & Evolution, 56(1): 115-124.

Grant W, Bowen BW. 1998. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]. Journal of Heredity, 89(5): 415-426.

Honda M, Yasukawa Y, Ren H,etal. 2002. Phylogenetic relationships of the Asian box turtles of the genusCuorasensu lato (Reptilia: Bataguridae) inferred from mitochondrial DNA sequences[J]. Zoologicalence, 19(11): 1305-1312.

Huang Z, Liu N, Luo S,etal. 2007. Ecological genetics of rusty-necklaced partridge (Alectorismagna): environmental factors and population genetic variability correlations[J]. Korean Journal of Genetics, 29(2): 115-120.

Jin YT, Liu NF. 2008. Ecological genetics ofPhrynocephalusvlangaliion the North Tibetan (Qinghai) Plateau: correlation between environmental factors and population genetic variability[J]. Biochemical Genetics, 46(9-10): 598-604.

Joos F, Spahni R. 2008. Rates of change in natural and anthropogenic radiative forcing over the past 20,000 years[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(5): 1425-1430.

Kim M, Ahn IY, Cheon J,etal. 2009. Molecular cloning and thermal stress-induced expression of a pi-class glutathione S-transferase (GST) in the Antarctic bivalveLaternulaelliptica[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part A Molecular & Integrative Physiology, 152(2): 207-213.

Kirkendale LA, Meyer CP. 2004. Phylogeography of thePatelloidaprofunda group (Gastropoda: Lottiidae): diversification in a dispersal-driven marine system[J]. Molecular Ecology, 13(9): 2749-2762.

Kumar S, Stecher G, Tamura K. 2016. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets.[J]. Molecular Biology & Evolution, 33(7): 1870.

Librado P, Rozas J. 2009. DnaSP v5[J]. Bioinformatics, 25(11): 1451-1452.

Lindberg DR. 1990. Systematics ofPotamacmaeafluviatilis(Blanford): a brackish water patellogastropod (Patelloidinae: Lottiidae)[J]. Journal of Molluscan Studies, 56(2): 309-316.

Michod RE. 1981. Ecological genetics[J]. Science, 212(4491): 154-155.

Monari M, Matozzo V, Foschi J,etal. 2007. Effects of high temperatures on functional responses of haemocytes in the clamChameleagallina[J]. Fish & Shellfish Immunology, 22(1-2): 98-114.

Nakai S, Miura O, Maki M,etal. 2006. Morphological and habitat divergence in the intertidal limpetPatelloidapygmaea[J]. Marine Biology, 149(3): 515-523.

Nakano T, Ozawa T. 2007. Worldwide phylogeography of limpets of the order Patellogastropoda: molecular, morphological and palaeontological evidence[J]. Journal of Molluscan Studies, 73(1): 79-99.

Nevo E. 1981. Genetic variation and climatic selection in the lizardAgamastellioin Israel and Sinai[J]. Theoretical and Applied Genetics, 60(6): 369-380.

Ni G, Li Q, Kong L,etal. 2012. Phylogeography of the bivalveTegillarcagranosain coastal China: implications for management and conservation[J]. Marine Ecology Progress, 452: 119-130.

Scheiner SM. 1993. Genetics and evolution of phenotypic plasticity[J]. Annual Review of Ecology & Systematics, 24(1): 35-68.

Slatkin M. 1987. Gene flow and the geographic structure of natural populations[J]. Science, 236(4803): 787.

Surhone LM, Tennoe MT, Henssonow SF. 2010.Patelloidapygmaea[M]. Saarbrücken: Betascript Publishing.

Takenori S, Takashi O. 1993. Anatomy and systematic position ofYayoiacmea, a new genus for Japanese tiny limpet “Collisella” oyamai Habe, 1955 (Gastropoda: Lottiidae)[J]. The Japanese Journal of Malacology, 52: 193-209.

Wayne, Robert K. 2004. Molecular markers, natural history and evolution[M]. Stamford: Sinauer Associates: 25-86.

Yu JH, Song JH, Choi MC,etal. 2009. Effects of water temperature change on immune function in surf clams,Mactraveneriformis(Bivalvia: Mactridae)[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 102(1): 30-35.

PopulationEcologicalGeneticsofPatelloidapygmaeaBasedonMitochondrial16SrRNAFragmentSequencesintheBohaiSea

SHI Boyang1, LI Yuanyuan1, WANG Ruxiao1, QU Jiangyong1, 2*, GUO Chenghua1*, LIU Chuanlin1, HOU Jianhai1, FANG Hui1, LIU Chutong1

(1. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai, Shandong Province 264005, China; 2. Hainan Key Laboratory for Herpetological Research, Hainan Tropical Ocean University, Sanya, Hainan Province 572000, China)

The relationship between genetic diversity and environmental factors of 15Patelloidapygmaeapopulations in the Bohai Sea was studied by PCR and DNA sequencing. A total of 264 polymorphic loci were found in the 16S rRNA partial sequence of the 180 individuals, and 153 transitions as well as 114 transversions were defined by 32 haplotypes. The base contents of C, T, A and G were 18.12%, 27.74%, 33.07%, and 21.07%, respectively. The haplotype diversity was 0.835 1±0.019 1, and the nucleotide diversity was 0.449±0.214. Moreover, the nucleotide diversity ofP.pygmaeapopulation in the coast (0.191 8±0.091 7) was higher than that of island (0.107 3±0.081 6), and the results of population demographic history indicated that the populations ofP.pygmaeamay have experienced a recent demographic expansion. The correlation analysis between environmental factors and genetic factors showed that the genetic distance, sequence variation and nucleotide diversity ofP.pygmaeawere significantly positive correlated with sunshine duration and sunshine percentage (P<0.05). The result of morphological correlation analysis showed that the main components (length and width) were significantly negative correlated with the annual average precipitation (P<0.05). Average annual precipitation, sunshine duration and sunshine percentage were the dominant factors ofP.pygmaeamorphological variation, and the population genetic diversity will be higher in the the area with high environmental stablility.

Patelloidapygmaea; 16S rRNA; ecological genetical; genetic diversity

2017-01-12接受日期：2017-03-28

國家自然科學基金地區基金項目(31460562)； 煙臺大學博士科研啟動經費(SM15B01)； 2016年國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201611066009)； 煙臺大學研究生科技創新基金項目； 煙臺大學開放實驗室項目

史博洋, 碩士研究生, 主要從事海洋生物學研究, E-mail:sby_hope@163.com

*通信作者Corresponding author, E-mail:qjy@ytu.edu.cn; gch@ytu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170013

Q145； Q346

： A

： 1000-7083(2017)04-0386-06