滅菌豆干貨架期內品質變化及微生物群落多樣性分析

李志波，劉特元，錢植龍，楊忠明，劉忠祥，梁天姣

（湖南省華文食品有限公司，湖南岳陽414000）

滅菌豆干貨架期內品質變化及微生物群落多樣性分析

李志波，劉特元，錢植龍，楊忠明，劉忠祥，梁天姣

（湖南省華文食品有限公司，湖南岳陽414000）

取車間生產的滅菌前的預包裝香辣味豆干為材料，在實驗室進行105℃、40 min的熱處理，研究其常溫保存條件下貨架期30 d后的品質變化及微生物狀況。結果表明，實驗樣品在貯藏30 d后生長了大量細菌和真菌，其菌落總數達到了6×105CFU/g，微生物含量嚴重超標，且產生的代謝物導致樣品酸味突出，口感變糙。高通量測序及分析顯示，實驗樣本中芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物占比細菌含量為80.69%，為絕對優勢細菌，酵母菌（Saccharomycetes）為主要優勢真菌，占比真菌含量為32.99%。而進一步的研究發現，熱噬淀粉芽孢桿菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）是本實驗中主要的腐敗細菌。

豆干；品質；微生物群落；食品安全性

兩千多年來，豆制品以其獨特的風味、嫩滑的口感、豐富的營養價值和食療價值備受人們的青睞，是中華傳統美食文化中不可或缺的一部分。近些年，我國豆制品市場容量持續擴大，促進著豆制品行業的不斷發展[1]。然而豆制品這種豐富的營養體，在生產衛生條件控制不好或終產品滅菌條件達不到要求等的情況下，貨架期內很容易發展成為適合多種類群微生物生長、繁殖的天然培養基。當這些微生物類群在豆制品中的數量或代謝產物累積到一定程度時，便可能引起食品的腐敗變質或食源性疾病。食品安全問題關系到企業的發展和消費者的健康，有關豆制品會帶來的致病菌生長及其產毒素能力有資料曾做過評估[2-3]，國外曾報導過豆制品滋生志賀氏菌（Shigella sonnei）和耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）引起食品中毒事件[4-5]，國內彭玲慧等[6-7]也從豆制品中分離到致病菌蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。在如今我國豆制品市場消費量增長迅速而豆制品行業發展相對滯后的情況下，加強豆制品開發的基礎研究并改良生產工藝，對于提高豆制品的生產效能和食品安全性十分重要。

豆制品生產流程比較繁瑣，需要控制的關鍵點很多，各道工序之間關系復雜，但它們共同作用的結果最終都會表現在產品的品質和食品安全性上。殺菌是成品外包裝前的最后一道重要工序，其不同的操作條件之于產品的物性和食品的安全性會存在一定的“拮抗”效果[8]。其具體內容為：在殺菌時間相差不是很大的情況下，滅菌溫度高（115～121℃）時會提高食品安全性但不利于產品的物性，滅菌溫度低（98～105℃）時產品物性更好但不利于食品安全性。鑒于此，本實驗以相對低溫105℃（40 min）對包裝后豆干進行殺菌處理，貯藏一個月后檢測產品品質的變化和微生物群落多樣性，再以此為基礎結合生產環境、滅菌技術等來分析和探討怎樣較好地平衡豆制品產品品質與食品安全性之間的關系，以期為豆干及其他豆制品的安全生產和品質保證提供相關理論數據和合理建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆干樣品采自湖南省華文食品有限公司（25 g預包裝產品），MC培養基、MRS培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；平板計數瓊脂（plate count agar）培養基：上海盛思生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YX-350Z型高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；DH5000Ⅱ型恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；KDN智能型凱式定氮儀：上海精隆科學儀器有限公司；202-1型電熱恒溫干燥箱：北京科偉永興一起有限公司；S8-Biotech Kit型pH計：梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

取湖南省華文食品有限公司生產的25 g香辣味預包裝（真空）鹵制豆腐干為實驗樣品，經105℃滅菌40 min后室內常溫放置30 d，低溫（2～8℃）保存備用。

取一部分混合均勻樣品檢測各理化指標，水分、蛋白質、脂肪、碳水化合物、鈉、微生物菌落總數分別參照國標GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》、GB5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》、GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》、GB10769—2010《嬰幼兒谷類輔助食品》、GB/T23494—2009《豆腐干》、GB 4789.2—2010《菌落總數測定》檢測。

另于無菌條件下取25 g混勻樣品，剪碎，置于225 mL無菌水（pH值為6.35）搖勻制成菌懸液，取適量涂布于MRS培養基，37℃培養36 h后觀察菌落生長狀況并進行劃線分離純化。再取一部分樣品并同分離的優勢菌送上海生工生物工程有限公司進行宏基因組微生物分類測序，其中細菌16S rDNA測序基因擴增區域為V3-V4區，真菌測序基因擴增區域為ITS1-ITS2區。

2 結果與分析

2.1 實驗豆干的物性變化

由表1可知，經實驗條件滅菌處理1 d后豆干外部呈黃色、內部乳白色，香味濃厚，具有較好的滑、軟、彈性，味道正常，氣孔較少，結構緊湊，切面光滑。而常溫貯藏30 d后，豆干的顏色、氣味、口感及內部質構都發生了較為明顯的變化，其內部顏色較之前稍顯變黃，豆干出現酸味，口感比較粗糙，并且內部質構孔隙增多，發硬成塊狀感，但未出現脹包情況。

表1 實驗豆干貯藏1 d和30 d后的感官評價Table 1 Sensory evaluation of experimental dried bean curd after 1 d and 30 d storage

貯藏30 d內，豆干的主要理化指標及微生物指標檢測結果見表2，其與初始豆干（貯藏0 d）的主要理化指標基本相同，但微生物菌總數明顯增長，達到了6×105CFU/g。另外，貯藏30 d后豆干的pH檢測值明顯下降，比初始狀態較低了約1.1（初始狀態pH值為5.82左右）。這說明，實驗滅菌條件不足以殺滅樣品中所有的微生物體，而這類經105℃滅菌40 min仍存活的微生物體的菌相特征為：都具有良好的耐熱性、具產酸能力的菌種、代謝途徑都為同型發酵。

表2 實驗豆干貯藏30 d內的主要理化指標及菌落總數Table 2 Main physical and chemical indicators and total bacterial count of experimental dried bean curd in 30 d storage

2.2 實驗樣本中細菌的多樣性分析

2.2.1 細菌群落高通量測序分析

高通量測序過程中，測序序列數目達到79 603，其Simpson多樣性指數為0.33，說明樣本中有著較為豐富的細菌種類及數量。屬水平樣本的豐度餅圖見圖1。由圖1可知，芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactobacillus）在測序過程中的reads數目＞1 000，為樣本中的主要微生物類群，而芽孢桿菌屬微生物優勢十分突出，其含量達到了細菌總數的80.69%。由圖2可知，樣本中細菌集中在厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），有著較高的遺傳多樣性。

圖1 細菌屬水平樣本的豐度餅圖Fig.1 Abundance pie chart of bacteria at genus level

圖2 細菌分類和系統發育信息可視化圖Fig.2 Visualization diagram of bacterial classification and phylogenetic information

一些學者研究認為豆腐的腐敗與樣品的物理性質及初始微生物狀況密切相關。許多研究證明了此觀點[9]，如FOUAD K E等[10]的研究表明，石膏豆腐在低溫（2～3℃）貯存條件下貯存30 d后的主要腐敗菌有乳酸菌（lactic acid bacteria）、腸道菌（enteric bacteria）及假單胞菌屬（Pseudomonas）。TUITEMWONG K等[11]分離自7℃貯藏1 d和30 d后豆干中的微生物類群為鏈球菌屬（Streptococcusspp.）、片球菌屬（Pediococcussp.）、乳桿菌屬（Lactobacillusspp.）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas pyocyaneum）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）及產氣桿菌（Enterobacter agglomerans）。李除夕等[7]的研究結果顯示，豆腐貨架期內的主要腐敗菌為穩桿菌屬（Empedobacter）、庫特氏菌屬（Kurthia gibsonii）和芽孢桿菌屬（Bacillus cereus）。鄧勇等[12]的研究認為內酯豆腐中的腐敗菌為凝結芽孢桿菌（Bacillus eoagulaus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），且其數量分別占總菌數的15%和75%。在本研究結果出現的4大微生物屬中，類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）為特定存在的微生物類群，其他3類在以上研究中都有出現。

2.2.2 酸敗優勢細菌分析

本實驗豆干貯藏期間殘存的細菌能夠適應真空包裝環境，并利用豆干豐富的營養物質進行生長和繁殖。其中一些物種能夠產生某些引起豆干物性改變的代謝產物，并最終導致豆干難以被接受，是該產品在本實驗處理條件（105℃滅菌）下的特定腐敗細菌。而本實驗豆干最為明顯的改變是樣品內出現了酸性物質，且這些酸性物質又可能引起了豆干內部質構的變化。

取實驗樣品制成菌懸液并接種于MRS培養基上，于37℃培養36 h。結合菌落形態分析及生理生化試驗，初步分離并純化出兩株優勢微生物。而分子鑒定結果顯示，這兩株菌為熱噬淀粉芽孢桿菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii），其菌體的革蘭氏染色結果見圖3。

圖3 熱噬淀粉芽孢桿菌(A)及德氏乳桿菌(B)革蘭氏染色圖(10×100）Fig.3 Gram stain ofBacillus thermoamylovorans(A)and Lactobacillus delbrueckii(B)

由圖3可知，兩株菌均為革蘭氏陰性菌。本研究中，105℃滅菌豆干30d貨架期內的酸敗應當主要為熱噬淀粉芽孢桿菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）共同作用的結果，它們屬于本實驗樣品的特定腐敗細菌，能夠代謝碳水化合物產生有機酸[13-14]。

2.3 實驗樣本中真菌的多樣性分析

實驗樣本中也存在一定數量和種類的真菌，其測序序列數目為22 166，Simpson多樣性指數為0.12。屬水平樣本的豐度餅圖見圖4，可視化系統發育信息圖見圖5。

由圖4可知，酵母菌（Saccharomycetes）為樣本中真菌微生物的優勢類別，其所占真菌比例為32.99%，占整個樣品微生物群落的比例為7.19%。而測序過程中reads數目大于1000的還有假絲酵母屬（Candida）、發菌科（Trichocomaceae）及一未分類類群，它們構成了實驗樣本的主要真菌類群。另外Incertae sedis、Khuskia、Monascaceae、Pseudozyma、Issatchenkia、Eurotiomycetes、Ceratobasidiaceae、Pleurotus、Sarocladium及Aspergillus類群真菌在樣本中也有一定含量。

圖4 真菌屬水平樣本的豐度餅圖Fig.4 Abundance pie chart of fungi at Genus level

圖5 真菌分類和系統發育信息可視化圖Fig.5 Visualization diagram of fungi classification and phylogenetic information

由圖5可知，樣本中檢測到的真菌歸屬于子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和接合菌門（Zygomycota）。它們聚類范圍分布廣，親緣關系較遠，表明有許多類別的真菌或其孢子在105℃實驗條件處理下能夠保存下來，并在貯藏過程中得以生長和繁殖。

2.4 討論

本實驗中，低溫（105℃）滅菌的實驗樣品貯存一個月后產生了明顯的酸敗現象，以熱噬淀粉芽孢桿菌和德氏乳桿菌為主的耐熱菌應當是引發酸敗的主要微生物類群；而滋生的大量其他芽孢桿菌、類芽孢桿菌、酵母菌等微生物不僅引起樣品微生物超標，還可能生長有致病微生物，并且對豆干的質構及口味產生破壞效果。采用115℃滅菌40 min條件下滅菌產品在相當時間的貨架期內能保持無菌狀態。為此損失了一部分的產品特性并提高了成本，但其風味和口感仍能達到要求。針對目前市場上非發酵豆制品菌落總數合格率較低的狀況[15]，建議豆制品生產企業在能夠滿足品質要求的情況下，適當提高殺菌溫度，以達到較好的食品微生物安全性。

豆制品工藝的復雜性使得生產過程中對微生物污染的控制難度也很大。豆腐從磨漿到烘烤前是微生物侵襲的主要階段，而包括原料、水所載荷的和空氣中浮游的微生物是主要的污染來源[16]，當這些微生物進入到豆漿和豆腐這類合適的基質時便能迅速生長和繁殖。尤其當采用生漿工藝、低溫點漿（60℃左右），較長時間的蹲腦和壓榨等這類工藝時，一些耐熱并適應豆漿營養環境的微生物則能獲得更好的生長條件和繁殖時間。對于持續生產的豆制品車間，若設備管道清洗不及時不到位而殘留有豆漿等物料、產生的黃漿水和報廢品清理不及時不完全，則在氣溫較高的季節很容易形成微生物發展的溫床，繼而引起車間環境和豆胚的嚴重生物污染。因此，注重對生產環境的清理和控制、采取好的車間殺菌措施等有利于保證好的豆胚品質，并能在一定程度上降低成品的殺菌要求，實現豆制品品質與殺菌條件的更好平衡。

超高壓滅菌技術在豆制品生產中的運用條件和要求，對于獲得更好物性的豆制品是一條很有空間的途徑。另外，加強豆制品的制作、保藏等相關方面的的理論研究對于豆制品行業的健康發展也是十分必須的。檢測不同環境條件、不同生產工藝、不同初始微生物和不同運輸、貯藏狀況下微生物污染的發展程度和方向，再以此為數據基礎建立生產過程和貨架期內微生物變化的預測模型，能夠有效地從宏觀上把控不同階段微生物的微觀變化情況。

3 結論

105℃滅菌豆干貯藏30 d后，微生物含量嚴重超標，其色、香、味及內部質構較初始狀況都發生了一定變化，酸味突出，結構變糙。

實驗樣本中細菌的多樣性豐富，芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物是主要類群（80.69%），而類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）微生物的含量也較大，其占比分為3.70%、1.52%、1.37%。分離鑒定出的熱噬淀粉芽孢桿菌（Bacillus thermoamylovorans）和德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）是本實驗中主要的腐敗細菌。

實驗樣本中存在一定數量和種類的真菌，酵母菌（Saccharomycetes）、假絲酵母屬（Candida）、發菌科（Trichocomaceae）微生物是已分類出的主要類群，其含量分別為32.99%、5.57%、5.33%。

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Quality change and microbial community diversity analysis of sterilized dried bean curd in shelf life

LI Zhibo,LIU Teyuan,QIAN Zhilong,YANG Zhongming,LIU Zhongxiang,LIANG Tianjiao
(Hunan Huawen Food Co.,Ltd.,Yueyang 414000,China)

Using the prepackaged spicy dried bean curd before sterilization from workshop production as material,heat treatment was conducted at 105℃for 40 min,to study its physical properties change and the status of the microbes after 30 d shelf life in normal temperature.The results showed that the experimental sample germinated large number of bacteria and fungi after 30 d storage.The total count of bacteria was 6×105CFU/g, it severely exceeded the limit,and the metabolites leaded to obvious sour and rough taste.High throughput sequencing and analysis results showed thatBacilluswas the dominate bacteria in the experimental samples and the proportion was 80.69%.Saccharomyceteswas the dominant fungi and the proportion was 32.99%.Further studies found thatBacillus thermoamylovoransandLactobacillus delbrueckiiwas the main spoilage bacteria in the experiment.

dried bean curd;quality;microbial community;food safety

Q93-331

0254-5071（2017）07-0124-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.027

2016-12-20

李志波（1989-），男，工程師，碩士，研究方向為豆制品加工技術。