檸檬酸和氯化鈉抑制地衣芽孢桿菌生物被膜的研究

侯佳啟，林敏，周亞彬，馬崇禮，畢旺來*，李睿

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

檸檬酸和氯化鈉抑制地衣芽孢桿菌生物被膜的研究

侯佳啟，林敏，周亞彬，馬崇禮，畢旺來*，李睿

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

地衣芽孢桿菌是食品中常見腐敗菌。該研究發現地衣芽孢桿菌在常見培養基（如TSB、NB、LB、1/2LB）中均有較強的產生物被膜能力，地衣芽孢桿菌稀釋100倍、在胰酪胨大豆肉湯（TSB）培養基中30℃靜置培養更利于地衣芽胞桿菌在96孔板上產生物被膜。測得地衣芽孢桿菌對檸檬酸和氯化鈉的最低抑菌質量濃度（MIC）分別為1.28 mg/mL和64 mg/mL。采用結晶紫染色法，研究不同質量濃度檸檬酸和氯化鈉對地衣芽孢桿菌生物被膜的抑制效果。結果顯示，1/2MIC的氯化鈉即能顯著抑制地衣芽孢桿菌生物被膜形成（P＜0.01）；而1/2MIC和1MIC的檸檬酸對地衣芽孢桿菌生物被膜形成無明顯抑制效果（P＞0.05）。

地衣芽孢桿菌；生物被膜；檸檬酸；氯化鈉；抑制效果

細菌生物膜（也稱生物被膜）是一種定植于物體表面的微生物聚集體，由細菌和自身分泌的胞外基質組成，廣泛存在于食品加工廠、污水排放系統等場所[1-2]。細菌生物膜能夠提供特殊的微環境和黏質物屏障作用，保護細菌免受外環境侵害，降低各類防腐劑和消毒措施的殺菌抑菌作用[3]。細菌生物膜不僅是細菌耐藥的主要原因之一，也能造成細菌在食品加工環境持續生長繁殖，從而導致食品腐敗，縮短食品保質期，影響食品安全[4-5]。因此細菌生物膜的防控已成為各國生物和食品學家研究的熱門領域之一[6-9]。

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）屬于革蘭氏陽性芽孢桿菌，能產生豐富的蛋白和淀粉分解酶，從而使肉、罐頭、豆類、淀粉食品等腐敗變質。地衣芽孢桿菌耐熱性強，抵抗不良環境能力強，因此是食品常見腐敗菌[10]。

檸檬酸和氯化鈉是食品常見添加劑，這兩種添加劑同時還具有一定的抑菌性能[11-12]。陳南南等[13]探究了檸檬酸對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、藤黃微球菌三種腐敗菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）；李雅麗等[14]的研究表明，地衣芽孢桿菌對氯化鈉不耐受；陳曉等[15]研究了地衣芽孢桿菌對不同防腐劑的敏感性，結果表明地衣芽孢桿菌對山梨酸鉀、乳酸鈉不敏感，對Nisin、ξ-聚賴氨酸和尼泊金乙酯較為敏感。

地衣芽孢桿菌生物膜的形成機理目前尚未有詳細研究。本實驗主要研究地衣芽孢桿菌生物膜的形成條件以及檸檬酸和氯化鈉對地衣芽孢桿菌生物膜的影響，旨在為食品防腐提供參考，為企業應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）：由本實驗室分離，上海生工生物公司經16S rRNA基因測序鑒定。

1.1.2 實驗試劑

氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、大豆蛋白胨、葡萄糖、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；刀豆蛋白A（FITC-Con A）：美國Vector Laboratories公司；蛋白胨：英國OXOID公司；結晶紫：武漢市華順生物技術有限公司。

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticsoybroth，TSB）培養基、營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基、溶菌肉湯（lysogenybroth，LB）培養基、1/2LB、MH肉湯（mueller-hinton broth，MHB）培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

THZ-22型恒溫搖床：太倉市實驗設備廠；V-1100D型可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；SL302型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；UPY-III-103純水制備成套設備：四川優普超純科技有限公司；PYX-150S-B生化培養箱：科力儀器有限公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺；SUNRISE酶標儀：英國TECAN公司；COSTAR 96孔細胞培養板：美國Corning公司；ECLIPSE 80i顯微鏡：尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 地衣芽孢桿菌的產膜條件實驗

將地衣芽孢桿菌分別接種到TSB、NB、LB、1/2LB四種培養基中，37℃、150 r/min培養至OD600nm約為1.0，用相應培養基50倍和100倍稀釋菌液備用。各取150 μL不同濃度菌液于96孔細胞培養板中，分別于30℃、37℃靜置培養72 h，每一實驗組和陰性對照組各設置至少3個平行孔，陰性對照組為只加無菌培養基，平行試驗3次。用結晶紫染色法測定膜產量。

1.3.2 NaCl和檸檬酸的最小抑菌濃度的測定

將地衣芽孢桿菌接種到MHB培養基中，37℃、150r/min恒溫振蕩培養至OD600nm約為1.0，50倍稀釋菌液備用。配制5.12 mg/mL檸檬酸母液、256 mg/mL氯化鈉母液，按參考文獻[16]的方法進行系列倍比稀釋。取50 μL菌液與50 μL不同濃度的氯化鈉或檸檬酸加入96孔細胞培養板中，37℃靜置培養24h，并設置陽性對照組（50μL菌液與50μLMHB混合）和陰性對照組（只加100 μL MHB），每一實驗組和對照組各設置至少三個平行孔。平行試驗3次。

1.3.3 地衣芽孢桿菌生物膜熒光觀察

將地衣芽孢桿菌接種到TSB培養基中，37℃、150r/min培養14 h左右，培養至OD600nm約為1.0。用新鮮TSB稀釋100倍，即調整菌液濃度為105CFU/mL，備用。在6孔細胞培養板中放置無菌蓋玻片，取2 mL菌液轉接于6孔細胞培養板，30℃分別靜置培養24h、48h、72h。培養結束后，撈出蓋玻片，取pH值為7.2的磷酸鹽緩沖溶液（phospbatebuffersaline，PBS）洗滌蓋玻片上的浮游菌，取200 μL 20 μg/mL FITC-ConA均勻滴加到蓋玻片上，37℃條件下遮光處理30 min，用PBS洗滌2次，洗去殘液后，熒光顯微鏡下觀察生物膜形態與結構。

1.3.4 氯化鈉、檸檬酸對地衣芽孢桿菌生物膜形成的影響

將地衣芽孢桿菌接種到TSB培養基中，37℃、150 r/min培養14h，培養至OD600nm約為1.0。用新鮮TSB稀釋50倍，即調整菌液濃度為106CFU/mL，備用。取75μL菌液加入96孔細胞培養板，再分別加入75μL的256mg/mL（4MIC）、128mg/mL（2MIC）、64 mg/mL（MIC）氯化鈉，30℃靜置培養72 h，并做陽性對照組（75 μL菌液與75 μL TSB混合）與陰性對照組（只加150 μL TSB）。培養完成后，棄菌液，進行結晶紫染色測定生物膜。氯化鈉母液用TSB溶解配置。檸檬酸處理方式同上。

1.3.5 結晶紫染色測定生物膜

[17]方法并略有修改。取200μLPBS（pH7.2）洗滌生物膜2次。37℃干燥40min后，每孔中加入200μL0.1%結晶紫，37℃染色15 min，用PBS洗滌2次，干燥。每孔加入200 μL體積分數95%的無水乙醇，靜置直至生物膜完全脫色，將染液轉移至新的96孔細胞培養板中，在波長600 nm處測量吸光度值，每一實驗組和對照組設置至少3個平行對照孔，取平均值。實驗進行3次重復。計算公式如下：

樣品最終OD值=樣品平均OD值-陰性對照OD平均值

2 結果與分析

研究表明，溫度、菌液濃度、營養條件是影響微生物生物膜的形成的重要因素[2]，因此本研究分別測定了溫度、菌液濃度、培養基種類對地衣芽孢桿菌生物膜形成的影響。

2.1 地衣芽孢桿菌產膜條件

在50倍稀釋菌液條件下，考察不同溫度條件下地衣芽孢桿菌在不同培養基中產膜能力，結果見圖1。

圖1 不同溫度條件下地衣芽孢桿菌在不同培養基中產生物被膜能力比較Fig.1 Comparison of the biofilm formation ability ofB.licheniformis in different mediums and temperature

由圖1可知，在30℃條件下，TSB、NB、LB、1/2LB四種培養基中地衣芽孢桿菌產生的生物膜量均高于37℃條件下的生物膜量。

在30℃條件下，考察不同菌液濃度時地衣芽孢桿菌在不同培養基中產膜能力，結果見圖2。

圖2 不同菌液濃度下地衣芽孢桿菌在不同培養基中產生物被膜能力比較Fig.2 Comparison of the biofilm formation ability ofB.licheniformis in different mediums and concentrations of bacterial solution

由圖2可知，地衣芽孢桿菌100倍稀釋菌液（100*表示）在TSB、NB、1/2LB培養基中產生的生物膜量均高于50倍稀釋菌液（50*表示），LB培養基恰好相反。

在30℃、100倍稀釋菌液條件下，考察不同培養基對地衣芽孢桿菌產膜能力的影響，結果見圖3。

圖3 不同培養基對地衣芽孢桿菌產生物被膜能力的影響Fig.3 Effect of different mediums on the biofilm formation ability of B.licheniformis

由圖3可知，地衣芽孢桿菌在TSB、NB、LB、1/2LB四種培養基中均有較強的產膜能力，地衣芽孢桿菌在LB培養基中產膜最弱。

因此，本實驗最終確定的地衣芽孢桿菌產膜條件為：地衣芽孢桿菌起始菌液濃度105CFU/mL左右（即將培養至OD600nm值約為1.0的地衣芽孢桿菌稀釋100倍），TSB培養基中30℃靜置培養。

2.2 氯化鈉和檸檬酸的MIC測定

按2012 CLSCI抗菌藥物敏感性試驗執行標準測定MIC，通過二倍稀釋法得出，氯化鈉對地衣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為64 mg/mL，檸檬酸對地衣芽孢桿菌的最低抑菌濃度為1.28 mg/mL。

2.3 地衣芽孢桿菌生物膜熒光觀察

地衣芽孢桿菌在TSB中培養24 h，經FITC-Con A染色后用熒光顯微鏡觀察，可見蓋玻片表面有綠色絮樣、不定形團塊，即為地衣芽孢桿菌早期生物膜。48 h、72 h后的生物膜量明顯增多，形成更為密集、體積更大的團塊狀、絮樣結構，玻璃表面的透光度明顯降低，生物膜的結構更為致密。

2.4 氯化鈉、檸檬酸對地衣芽孢桿菌生物膜的抑制作用

將地衣芽孢桿菌稀釋菌液與不同含量的氯化鈉或檸檬酸混合，加入96孔細胞培養板，使檸檬酸、氯化鈉終濃度約為1/2MIC、MIC、2MIC。30℃靜置培養72 h，地衣芽孢桿菌可在細胞培養板孔的側壁和氣液交界面上均形成肉眼可見的膜。用吸頭輕輕去掉氣液交界面上漂浮的膜和菌液，將粘附在孔側壁上的生物膜洗滌烘干，用結晶紫法測定生物膜量。

圖4不同氯化鈉質量濃度對地衣芽孢桿菌生物被膜抑制效果Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of sodium chloride onB.licheniformisbiofilm

圖4 可見，各樣品組的OD600nm值與對照組比較，均出現了極顯著差異（P＜0.01），表明1/2MIC的氯化鈉（32mg/mL）即能顯著抑制地衣芽孢桿菌生物膜形成。

2.4.2 檸檬酸抑制地衣芽孢桿菌生物膜形成的影響結果

圖5 不同檸檬酸質量濃度對地衣芽孢桿菌生物被膜抑制效果Fig.5 Inhibitory effects of different concentrations of citric acid on B.licheniformisbiofilm

由圖5可見，各樣品組的OD600nm值與對照組比較，僅2.56mg/mL（2MIC）檸檬酸組出現了極顯著差異（P＜0.01），表明加入較高濃度的檸檬酸能顯著抑制地衣芽孢桿菌生物膜的生成，而1/2MIC和MIC的檸檬酸對地衣芽孢桿菌生物膜形成無明顯抑制效果（P＞0.05）。

3 結論

本試驗研究了地衣芽孢桿菌生物膜最適生長條件，以及檸檬酸和氯化鈉對地衣芽孢桿菌生物膜的抑制效果。研究結果表明，地衣芽孢桿菌產膜能力很強，在營養豐富的培養基如TSB、LB，營養簡單的培養基如NB、1/2LB上均能產生肉眼可見的生物膜。低溫（30℃）比高溫（37℃）更有利于地衣芽孢桿菌產生物膜。結果顯示低于最低抑菌濃度的氯化鈉即能有效抑制地衣芽孢桿菌生物膜的形成，低于最低抑菌濃度的氯化鈉有可能通過減少細菌運動性能、減少細菌附著到固定載體上，從而抑制地衣芽孢桿菌形成生物膜[2]；1/2MIC和MIC的檸檬酸對地衣芽孢桿菌生物膜形成無明顯抑制效果，說明高濃度的檸檬酸主要通過抑制細菌生長、減少細菌數目，從而減少生物膜產生。

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Inhibitory effects of citric acid and sodium chloride onBacillus licheniformisbiofilm

HOU Jiaqi,LIN Min,ZHOU Yabin,MA Chongli,BI Wanglai*,LI Rui
(College of Biological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Bacillus licheniformisis a common spoilage bacterium in food.This studly showed thatB.licheniformisall had strong biofilm formation ability in the common medium(including TSB,NB,LB and 1/2LB).The bacterial solution ofB.licheniformiswas diluted 100 times and was cultured in the tryptic soytone broth(TSB)medium at 30℃,which was more beneficial to the formation ofB.licheniformisbiofilm on the 96-well plate.The minimum inhibitoryconcentration(MIC)ofB.licheniformison citric acid and sodium chloride were 1.28 mg/ml and 64 mg/ml,respectively.By crystal violet staining,the inhibitory effect of different concentration of citric acid and sodium chloride onB.licheniformisbiofilm was researched.The results showed that 1/2MIC sodium chloride could significantly inhibit the formation ofB.licheniformisbiofilm(P＜0.01),while 1/2MIC and 1MIC citric acid had no significant inhibitory effect on the formation ofB.licheniformisbiofilm(P＞0.05).

Bacillus licheniformis;biofilm;citric acid;sodium chloride;inhibitory effect

R155.5

0254-5071（2017）07-0110-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.024

2017-02-21

企業委托項目（2016）；武漢輕工大學大學生科研創新項目（2016）

侯佳啟（1995-），男，本科生，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：畢旺來（1972-），男，實驗員，本科，研究方向為食品微生物。