高效液相色譜法同時測定健脾益腎方水提物中松果菊苷、丹酚酸B和大黃酸含量

何泰東，余曉丹，鄭平，鄒美南，張尚斌，陳劍平，李順民

（廣東省深圳市中醫(yī)院深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣東深圳518033）

高效液相色譜法同時測定健脾益腎方水提物中松果菊苷、丹酚酸B和大黃酸含量

何泰東，余曉丹，鄭平，鄒美南，張尚斌，陳劍平，李順民

（廣東省深圳市中醫(yī)院深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣東深圳518033）

目的建立同時測定健脾益腎方水提物中松果菊苷、丹酚酸B和大黃酸含量的高效液相色譜法。方法色譜柱采用InertsilODS－SP柱（150mm×4.6mm，5 m），以乙腈－0.2%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，流速為1.0mL／min，檢測波長330 nm（松果菊苷）、286 nm（丹酚酸B）、254 nm（大黃酸），進樣量10 L。結(jié)果松果菊苷、丹酚酸B、大黃酸檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為2.50～80.0 g／m L（r＝0.999 4），1.25～80.00 g／m L（r＝0.999 3），1.25～40.00 g／m L（r＝0.999 4）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD小于2%（n＝6）；平均回收率分別為100.01%，99.15%，98.95%，RSD均小于2%（n＝6）。結(jié)論該方法，操作簡單、重復性好、專屬性強，方法可靠，可作為健脾益腎方水提物中松果菊苷、丹酚酸B、大黃酸的含量測定方法。

健脾益腎方；高效液相色譜法；含量；松果菊苷；丹酚酸B；大黃酸

健脾益腎方是基于國醫(yī)大師鄧鐵濤教授“五臟相關(guān)學說”理論，并結(jié)合我院治療慢性腎衰竭20余年的臨床經(jīng)驗總結(jié)而成的有效方劑[1－2]。該方由黃芪、酒蓯蓉、丹參、大黃等8味藥組成，具有健脾益腎、活血化濁之功，主治慢性腎功能衰竭脾腎陽氣虛，兼有濕濁、水氣和瘀毒等證。方中酒蓯蓉溫腎扶陽、潤腸通便，丹參活血祛瘀，大黃消散結(jié)、蕩滌腸胃、推陳致新，均為該方的主要藥物，目前尚無其測定方法。其中酒蓯蓉的指標成分為松果菊苷，丹參的指標成分為丹酚酸B，大黃的指標成分為大黃酸[3－6]，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法，在同一條件下對以上3個成分同時進行測定，并進行了系統(tǒng)的方法學考察，以確保該方提取物在臨床和動物研究中有可行的質(zhì)量控制方法，也可為之后的制劑質(zhì)量控制研究提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC－20AT型高效液相色譜儀，包括柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器、LC solution色譜工作站（日本島津公司）；Sartorius BP 211D型電子天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；CQ－250－DST型超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)用光學器械廠）；TGL－21M型高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；FD－1C－80型冷凍干燥儀（上海比朗儀器有限公司）。

黃芪，白術(shù)，山藥，酒蓯蓉，豆蔻，丹參，大黃，炙甘草均購自深圳華輝藥業(yè)有限公司，批號分別為150621，141230，150615，150620，150617，150626，150104，150615，經(jīng)深圳市中醫(yī)院張尚斌主任中藥師鑒定為正品；松果菊苷對照品(批號為111670－201304，純度大于98%)，丹酚酸B對照品（批號為110821－201313，純度大于98%），大黃酸對照品（批號為110757－200206，純度大于98%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（默克公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 健脾益腎水提物的制備

按處方比例稱取黃芪、酒蓯蓉、丹參、大黃等8味藥材，置提取器中，第1次加10倍量水，第2次加8倍量水，煎煮2次，每次1 h。煎液濾過，濾液合并，離心后，用冷凍干燥機干燥，凍干粉置－20℃以下冰箱保存，備用。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Inertsil ODS－SP柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：0.2%磷酸溶液(A)，乙腈(B)，梯度洗脫(0～5min，90%A；5～10min，90%～80%A；10～30min，80%～50%A；30～40min，90%A)；流速：1.0m L／min；檢測波長：330 nm(松果菊苷)，286 nm(丹酚酸B)，254 nm (大黃酸)；進樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)按松果菊苷峰計算應不低于5 000，分離度大于1.5。

2.3 溶液制備

分別取松果菊苷、丹酚酸B和大黃酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1m L含80μg的混勻溶液，即得對照品溶液。取本品粉末0.2 g，精密稱定，放入50m L離心管內(nèi)，加入超純水20 mL，超聲30 min，放置室溫，混勻后離心，移取上清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按健脾益腎方提取制備工藝制得缺酒蓯蓉、丹參及大黃陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制得陰性對照品溶液。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：取2.3項下3種溶液各10μL，在擬訂色譜條件下進樣。結(jié)果供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相同的保留時間處有相同色譜峰，陰性對照品溶液則無此峰，表明無干擾（圖1）。

線性關(guān)系考察：精密吸取松果菊苷、丹酚酸B、大黃酸對照品貯備液，質(zhì)量濃度均為80μg／mL，加甲醇稀釋，分別制得質(zhì)量濃度在1.25～80μg／m L的系列母液，按上述色譜條件測得峰面積，并以峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X，μg／mL）繪制標準曲線并進行線性回歸。松果菊苷、丹酚酸B及大黃酸的回歸方程分別為Y＝13 084X＋16 222，r＝0.999 4；Y＝12 474X＋17 334， r＝0.999 3；Y＝33 371X＋10 863，r＝0.999 4。結(jié)果表明，松果菊苷、丹酚酸B、大黃酸質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.5～80.00，1.25～80.00，1.25～40.00μg／mL。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密量取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進樣6次。結(jié)果松果菊苷、丹酚酸B、大黃酸的RSD分別為1.1%，1.0%，0.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，24 h時進樣，每次10μL。結(jié)果松果菊苷、丹酚酸B、大黃酸峰面積的RSD分別為1.1%，1.8%，0.6%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同批樣品6份，依平行制備6份供試品溶液進行測定。結(jié)果松果菊苷、丹酚酸B、大黃酸含量的RSD分別為1.5%，0.5%，1.0%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品約0.1 g，精密稱定，共6份，分別加入混合對照品溶液（松果菊苷180μg，丹酚酸B 800μg，大黃酸30μg），按2.3項下操作方法制備溶液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.5 樣品含量測定

按擬訂方法對3批樣品進行測定，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 方法確定

中藥品質(zhì)可能受氣候、地域、土壤和采收季節(jié)等因素影響。健脾益腎方為中藥復方，其質(zhì)量也會受到以上因素的影響[7]。因此，制訂該方提取物的質(zhì)量控制方法，一方面，可確保標準化提取物的制備，為之后制劑質(zhì)量控制提供參考依據(jù)；另一方面可保證該方提取物在臨床研究和生物活性評價中的可重復性。HPLC是檢測物質(zhì)含量測定的常用手段之一，以HPLC具有的色譜峰的特征性，作為藥物指標性成分的含量測定和藥物鑒別的依據(jù)，是各國藥典共同采用的檢測方法，能客觀揭示和反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體性和特征性，用以評價中藥的真實性、有效性、穩(wěn)定性和一致性。因此，本研究中采用HPLC法測定健脾益腎方提取物中的指標性成分，建立該方提取的質(zhì)量控制手段。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3)

3.2 色譜條件選擇

松果菊苷、丹酚酸B和大黃酸的HPLC測定方法2015版《中國藥典》有收載，本研究中在以上條件的基礎(chǔ)上進行預試驗，以建立能同時滿足對3種成分進行有效分離的測定方法。比較發(fā)現(xiàn)，以0.2%磷酸溶液－乙腈為流動相進行梯度洗脫優(yōu)于0.2%甲酸和乙腈。

3.2 波長選擇

同時根據(jù)中國藥典[8]，選取3個成分各自的最大吸收波長作為檢測波長。對于色譜柱的選擇，本研究發(fā)現(xiàn)，長的色譜柱和短的色譜柱都能達到很好的分離，為縮短分析時間，因此選擇短的色譜柱。參照以上條件進行分析，樣品色譜圖呈現(xiàn)整體較好的色譜峰，各特征峰峰形好、保留時間適中，與其他組分能達到基線分離，且分離度好。此外，也嘗試對黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行測定[9－10]，但該成分與肉蓯蓉中含有的毛蕊花糖苷相互干擾大，因此未對其進行含量測定，這是本研究的不足之處。后續(xù)研究將考慮采用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(LC－MS)法對二者成分進行同時測定。

綜上所述，本研究中建立的含量測定方法，快速、簡便，采用一次提取，同時測定，減少了操作步驟，節(jié)約了時間和成本，從而提高了分析效率。該方法可作為健脾益腎方提取物內(nèi)在化學指標成分含量測定的質(zhì)控方法。

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Sim u ltaneously Content Determ ination of Echinacoside,Salvianolic Acid B and Rheic Acid in Jianpi Yishen Form ula by HPLC

He Taidong,Yu Xiaodan,Zheng Ping,Zou Meinan,Zhang Shangbin,Chen Jianping,Li Shunmin

(Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation Research in Shenzhen Hospital,Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518033)

Objective To establish an HPLC method for the content determination of echinacoside,salvianolic acid B and rheic acid in Jianpi Yishen Formual simultaneously.M ethods The Inertsil ODS－SP column(150 mm×4.6 mm,5μm)was adopted with acetonitrile－0.2%phosphoric acid as mobile phase using gradient program,the flowing rate was 1.0 mL／min,the detection wavelength was 330 nm(echinacea),286 nm(salvianolic acid B),and 254 nm(rhein acid),the sample size was 10μL.Results The calibration curves of echinacoside,salvianolic acid B and rheic acid were linear from 2.50－80.00μg／mL(r＝0.999 4),1.25－80.00μg／mL(r＝0.999 3),1.25－40.00(r＝0.999 4)μg／mL,the accuracy,stability,and reproducibility of the RSD were less than 2.00%(n＝6),the average recovery was 100.01%,99.15%,98.95%,respectively,the RSD was less than 2.00%(n＝6).Conclusion The method is simple,efficient,accurate and reproducible,which can be used for the content determination of echinacoside,salvianolic acid B and rheic acid in Jianpi Yishen Formula.

Jianpi Yishen Formula;HPLC;content;echinacoside;salvianolic acid B;rheic acid

R284.1

A

1006－4931(2017)11－0025－03

2016－10－01；

2017－02－03)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.11.008

廣東省自然科學基金項目[2015A 030310247]；廣東省中醫(yī)藥局項目[20162124]；廣東省深圳市科技計劃項目[JSGG20141017103353178，JCYJ20150401163247213，ZDSYS20160608151545865]。

何泰東，大學本科，副主任藥師，研究方向為中藥研究，（電子信箱）lycjp＠126.com。

李順民，博士研究生，教授，研究方向為中醫(yī)腎病研究，（電子信箱）zyylishunmin＠126.com。