紅花黃色素對糖尿病腎病的保護作用

高　燕　譚　虎　常　顯　劉　寧　鄭　鵬　袁魯亮

(河北大學附屬醫院腎內科，河北　保定　071000)

糖尿病腎病(DN)作為一種慢性疾病，約有10%的患者死于腎衰竭〔1,2〕，DN以腎小球受損、腎小球硬化及結節性病變為主〔3～5〕。NLRP3炎性小體是一種Nod樣受體蛋白3〔2,6〕，作為介導機體炎癥反應的重要物質，在DN的發生發展中扮演著重要的角色，但是其誘導炎性反應的相關作用和機制并未深入闡述。目前，針對DN缺少有效的治療方案。本研究通過分析紅花黃色素對DN基本生理指標的影響，從炎癥角度探討紅花黃色素治療DN的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、儀器與試藥雄性SPF級SD大鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，體質量(250±10)g，實驗動物許可證號：(粵)2013-0005。Trizol，Caspase1和NLRP3引物(生工生物工程科技有限公司)；胰島素(Eli-Lilly公司)；紅花黃色素氯化鈉注射液(山西華輝凱德制藥有限公司)；白細胞介素(IL)-18，腫瘤壞死因子(TNF)-α，IL-1β酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢華美生物技術有限公司)；BCA總蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；血糖試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；酶標儀；PCR儀(Thermo賽默飛世爾科技公司,美國)；電子天平(上海精天電子儀器有限公司)。動物高脂飼料(60%脂肪)購自廣東省實驗動物中心。

1.2造模分組和給藥造模前將動物分為正常組(12只)和模型組(48只)，模型組飼喂油脂含量為30%的高脂飼料，正常組為普通飼料。模型組動物按照20 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，連續注射3 d；正常組注射等體積的生理鹽水作為對照。持續觀察12 w，造模結束后尾靜脈取血，3 000 r/min離心10 min取血清，測定血清中空腹血糖(FBG)、TNF-α、IL-18、IL-1β等指標的含量。將模型組動物分成模型組、胰島素組(0.5 U/d)、紅花黃色素高劑量組(40 mg/kg)、紅花黃色素低劑量組(20 mg/kg)，正常組和模型組等量注射生理鹽水作為參照，給藥持續4 w，每2 w經尾靜脈取血測定血清中FBG、TNF-α、IL-18、IL-1β的含量，給藥結束后，采用10%的水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min后分離血清，用于測定血清相關指標；分離肝臟和腎臟稱重并計算臟器系數，腎臟凍存在-80℃冰箱中，備用。

1.3血清中相關指標的檢測方法血清中FBG、TNF-α、IL-18、IL-1β水平嚴格按照試劑盒說明書的方法進行測定。

1.4尿液中相關指標的測定收集各組24 h的尿液，在收集容器中加入0.8%硼酸，同時在容器下方放置冰袋，降低尿液的溫度防止蛋白出現腐敗變質，收集尿液之后，離心取上清液，采用BCA法測定尿蛋白(UPRO)含量，計算24 h尿蛋白排泄率。

1.5測定腎臟中Caspase1和NLRP3 mRNA表達精確稱取100 mg的腎臟組織,加入Trizol勻漿，每1 ml Trizol 加入 0.2 ml 三氯甲烷；在低溫條件下劇烈混合30 s后，12 000 r/min離心15 min，將水相層液體小心轉移至新的離心管中；然后加入0.5 ml異丙醇，混合均勻，室溫靜置10 min；隨后4℃，12 000 r/min離心10 min，可見少量 RNA 沉淀；吸棄上清溶液，用75%乙醇洗滌沉淀2次；7 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清，放置在潔凈的空氣中自然干燥，DEPC水溶解RNA沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測定RNA純度及濃度；計算總RNA濃度。將溶解后的RNA按試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增。引物如表1所示。擴增條件為95℃，2 min；95℃，5 s，60℃，32 s，共40個循環〔7，8〕。

1.6統計學分析采用SPSS17.0軟件，方差齊性使用t檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。

表1　引物序列

2　結　果

2.1給藥前后各組血清FBG、TNF-α、IL-18、IL-1β水平造模12 w之后，與正常組比較，模型組FBG水平明顯提高(P<0.01),提示模型成功；同時，TNF-α、IL-18、IL-1β含量也顯著升高(P<0.01)，提示動物出現一定程度的炎癥活化。見表2。給藥2 w后，與正常組相比，模型組各項指標顯著升高(P<0.01)，提示模型穩定。與模型組相比，胰島素組和紅花黃色素高劑量組血清中FBG、TNF-α、IL-18、IL-1β的含量顯著降低(P<0.01)，紅花黃色素低劑量組血清中FBG、TNF-α、IL-18含量也明顯降低(P<0.05)，但是未能降低血清中IL-1β 的含量。給藥4 w后，與模型組相比，胰島素組、紅花黃色素低、高劑量組血清FBG、TNF-α、IL-18、IL-1β含量均降低(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表2　給藥前正常組與模型組血清FBG、TNF-α、IL-18、IL-1β含量比較

與正常組比較:1)P<0.01

表3　給藥2 w、4 w后各組血清中FBG、TNF-α、IL-18、IL-1β的含量比較

與正常組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2各組24 h尿蛋白排泄率和尿蛋白含量與正常組比較，模型組、胰島素組、紅花黃色素低、高劑量組尿蛋白排泄率和UPRO含量均顯著提高(均P<0.01)，與模型組比較，胰島素組、紅花黃色素低、高劑量組UPRO含量及尿蛋白排泄率均顯著降低(P<0.01或P<0.05)。見表4。

表4　各組24 h尿蛋白排泄率和尿蛋白的含量

2.5各組肝臟和腎臟的臟器系數比較模型組的肝臟和腎臟系數均顯著高于正常組(P<0.01)，提示動物出現一定程度的肝腎損傷；胰島素組、紅花黃色素低、高劑量組肝臟、腎臟系數明顯低于模型組(P<0.01)。見表5。

2.6各組腎臟中Caspase1和NLRP3 mRNA表達模型組Caspase1(1.64±0.21)和NLRP3 mRNA(1.63±0.12)表達水平較正常組(0.42±0.05，0.57±0.08)明顯上升(P<0.01)，紅花黃色素低、高劑量組和胰島素組Caspase1(1.30±0.13，1.03±0.09，1.48±0.16)及NLRP3 mRNA(1.12±0.10，0.95±0.07，1.30±0.11)顯著下調表達(P<0.01)。

表5　各組肝臟和腎臟的臟器系數比較

3　討　論

近期研究表明NLRP3炎性小體的活化是DN的重要機制之一。DN出現在糖尿病后期，嚴重威脅病人的生存時間和生存質量，同時糖尿病后期伴隨組織損傷和微血管循環受阻，出現嚴重的炎癥反應，進一步加重DN。本研究發現紅花黃色素能顯著降低血清FBG含量，同時能下調動物UPRO以及尿蛋白排泄率，提示紅花黃色素不僅能夠抑制血糖升高，還能改善腎臟功能。

DN與機體的炎癥反應密切相關。NLRP3是機體固有免疫反應的起點。相關研究已經證實，高血糖作為一種誘導NLRP3活化的因素，能夠使NLRP3介導的免疫反應進一步產生其下游的IL-1β和IL-18，在這個機制過程中Caspase1是重要的活性蛋白，NLRP3-Caspase1激活進一步加重機體的炎癥反應，同時造成組織損傷和氧化應激等不良后果〔4,9〕。本研究結果提示紅花黃色素能夠抑制NLRP3和Caspase1介導的炎癥反應。TNF-α和IL-1β能夠促進機體產生黏附因子和趨化因子，進一步刺激腎臟系膜細胞的增殖，造成組織損傷。本實驗中紅花黃色素能顯著下調TNF-α和IL-1β水平，提示其具有很好的抗炎效果；IL-18能夠誘導INF-γ、MCP-1、IL-1、ICAM-1等生物活性因子的產生，長期作用下產生炎性浸潤和組織受損〔10，11〕。本研究發現紅花黃色素能下調血清IL-18表達，同時Ins也有相關的調控作用，揭示了IL-18和IL-1β的下調與血糖的水平相關，同時也有可能與紅花黃色素的抗炎作用有一定的聯系。

本研究結果顯示，紅花黃色素能顯著改善DN的病理狀態，其改善作用的發揮可能依賴于紅花黃色素抑制NLRP3-Caspase1的表達來降低機體的免疫炎癥，從而改善DN并發癥的產生。

1高國麗，車光升，董瑤，等.糖尿病腎病發病機制的研究進展〔J〕.中國老年學雜志,2007;27(22):2254-55.

2Gao P,Meng XF,Su H,etal.Thioredoxin-interacting protein mediates NALP3 inflammasome activation in podocytes during diabetic nephropathy〔J〕.Biochimica Et Biophysica Acta,2014;1843(11):2448-60.

3Bǎlǎsescu E,Ion DA,Cioplea M,etal.Caspases,cell death and diabetic nephropathy〔J〕.Rom J Intern Med,2015;53(4):296.

4Ibrahim DS,El-Maksoud MAEA.Effect of strawberry(Fragaria × ananassa ) leaves extract on diabetic nephropathy in rats〔J〕.Int J Exp Pathol,2015;96(2):87-93.

5Kim SM,Lee SH,Kim YG,etal.Hyperuricemia-induced NLRP3 activation of macrophage contributes to the progression of diabetic nephropathy〔J〕.Am J Phys Renal Phys,2015;308(9):637-2014.

6Shahzad K,Bock F,Dong W,etal.Nlrp3-inflammasome activation in non-myeloid-derived cells aggravates diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int,2015;87(1):74-84.

7Motawi TK,Ahmed SA,Hamed MA,etal.Combination of melatonin and certain drugs for treatment of diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetes in rats〔J〕.Diabetol Int,2016;7(4):1-12.

8Liu DX,Liu XM,Su Y,etal.Renal expression of proto-oncogene Ets-1 on matrix remodeling in experimental diabetic nephropathy〔J〕.Acta Histochemica,2011;113(5):527-33.

9顧晶.纈沙坦聯合黃葵膠囊治療高血壓合并糖尿病腎病的療效〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(23):6747-9.

10Shahzad K,Bock F,Wang H,etal.Activation of the Nlrp3 inflammasome via mitochondrial ROS in glomerular cells aggravates experimental diabetic nephropathy〔J〕.Diabetologie Und Stoffwechsel,2014;9(S01):496-504.

11Susztak K,Raff AC,Schiffer M,etal.Glucose-induced reactive oxygen species cause apoptosis of podocytes and podocyte depletion at the onset of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes,2006;55(1):225.