米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶酶學特性研究

朱建寧，張衛兵，張忠明，楊敏，文鵬程，宋雪梅，張丹妮

（1.甘肅省食品藥品監督管理局，甘肅蘭州730000；2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070）

米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶酶學特性研究

朱建寧1，張衛兵2*，張忠明2，楊敏2，文鵬程2，宋雪梅2，張丹妮2

（1.甘肅省食品藥品監督管理局，甘肅蘭州730000；2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070）

以米黑毛霉凝乳酶為研究對象，研究反應溫度、pH值、脫脂乳濃度、金屬離子對凝乳酶活力的影響。結果表明，米黑毛霉凝乳酶最適反應溫度為75℃，在35℃～45℃穩定性較好；米黑毛霉凝乳酶的最適pH值為6.0，在pH值為7.0～10.0時較為穩定；脫脂乳濃度為20.0%時，相對凝乳酶活力達到最大值；Mn2+、Mg2+、Na+對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，K+、Sn2+、Cu2+對凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。

凝乳酶；米黑毛霉；酶學特性

凝乳酶是一種最早在未斷奶的小牛胃中發現的天門冬氨酸蛋白酶，可專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞酪蛋白膠束使牛奶凝結，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成為干酪生產中形成質構和特殊風味的關鍵性酶，被廣泛應用于奶酪制作。動物凝乳酶最早被用于干酪生產，應用也最為廣泛，其產值占總量的70%。據統計，全世界每年要宰殺5 000萬頭小牛，以獲得凝乳酶，造成全球性小牛短缺，由于原料缺乏，凝乳酶價格昂貴。植物凝乳酶雖然來源廣泛，但其蛋白水解力強，并且受時間、地點等限制難以發展[1]。微生物由于生長周期短，產量大，受氣候、地域、時間限制小，用其生產凝乳酶成本較低、提取方便、經濟效益高，可以節約動、植物資源，所以微生物凝乳酶成為凝乳酶研究的熱點[2]。

國產凝乳酶的種質資源主要包括毛霉類、根霉類和曲霉類[3]。不同來源微生物凝乳酶的酶學特性差異很大。高維東等[4]對微小毛霉凝乳酶的酶學性質進行研究，結果表明酶的最適溫度為60℃，最適pH值為5.5，在65℃保溫5min活力損失95%；鈣離子是酶的激活劑，其含量與酶活力正相關，而鉀離子則對酶有抑制作用，氯化鈉對酶活力的影響不大。潘道東等[5]研究表明，根霉凝乳酶最適pH為5.7，在pH值為5.0～7.5時酶活力保持穩定；最適反應溫度45℃，60℃保持20min，則完全失活。

本試驗以米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶為對象，研究反應溫度、pH值、脫脂乳濃度、金屬離子對凝乳酶活力的影響，以期為凝乳酶的研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料米黑毛霉菌株：菌株為米黑毛霉UV-LiCl-6，由本實驗室選育并保藏。脫脂乳粉：黑龍江完達山乳業股份有限公司。麩皮，馬鈴薯。所用試劑均為市售國產分析純或化學純。

活化培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH值自然。基礎發酵培養基：將麩皮與水按1∶0.8（w/v）的比例混合，攪拌均勻，在121℃、0.15 MPa下滅菌20min。發酵培養基：將麩皮與營養液按1∶0.8（w/v）的比例混合，攪拌均勻，在121℃、0.15MPa下滅菌20min。

營養液：葡萄糖2.5 g，乳清粉2.0 g，硝酸銨1.0 g，以蒸餾水溶解后，鹽酸調pH值至6.0，定容到100m l。

1.1.2 實驗設備HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；AL204電子天平，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；NRY-200恒溫搖床，上海南榮實驗室設備有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化將米黑毛霉菌株UV-LiCl-6接種于斜面培養基進行活化，32℃培養4～5 d，待長滿黑色孢子后備用。

1.2.2 孢子懸浮液的制備向生長良好的試管斜面種子中加入10m l無菌生理鹽水，刮下孢子，移入裝有玻璃珠和無菌生理鹽水的三角瓶中振蕩，在搖床上振蕩打散，再用帶脫脂棉的漏斗進行過濾，調整孢子數為106個/m l。

1.2.3 粗酶液的制備將1 m l米黑毛霉種子液接入發酵培養基，32℃恒溫培養72 h。培養完成后，加入100 m l蒸餾水，20℃、180 r/min振蕩浸提1 h，浸提液用4層紗布過濾，濾液以10 000 r/min離心20min，上清液即為粗酶液。

1.2.4 酶活力的測定凝乳酶活力測定采用Arima等[6]的方法，用0.01 mol/L氯化鈣液配制10%脫脂奶粉液，配制后在室溫放置40min以上使用，當天使用，不宜冰箱放置。取5 m l 10%脫脂奶粉液在35℃保溫10 min，加0.5 m l適當稀釋的酶液（35℃保溫），立即搖勻，開始計時（凝乳時間控制在40～90 s），并把試管傾斜45°以上。沿試管周旋轉，以試管壁出現小顆粒為終點，記錄凝乳時間。在上述條件下，將40min凝1 m l 10%脫脂奶粉的酶量定義為一個Soxhlet單位（SU）。

公式中，D為酶液稀釋倍數，t為反應時間。

1.2.5 反應溫度對凝乳酶活力的影響將作用底物脫脂乳溶液分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃下保溫5min，把適當稀釋的凝乳酶在35℃下保溫5min待用，分別在相應溫度下加入0.5m l酶液測定凝乳酶活力，獲得最高凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力[7]。

1.2.6 凝乳酶的熱穩定性將酶液分別在35℃、45℃、55℃、65℃、70℃下保溫0、10、20、30、40、50、60min后，測定殘余凝乳酶活力，以未保溫酶液的凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

1.2.7 pH值對凝乳酶活力的影響用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH將脫脂乳和酶液pH值調至5.5、6.0、6.5、7.0，測定不同反應體系下的凝乳酶活力，以獲得的最高凝乳酶活力為100%（對照）。

1.2.8 凝乳酶的pH穩定性分別用0.1 mol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH值2.5～4.0）、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH值4.5～ 5.5）、磷酸鈉緩沖液（pH值6.0～8.5）、碳酸鹽緩沖液（pH值9.0～11.0）將酶液的pH值分別調節到3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，在室溫下放置24 h，再將pH值調到5.5，測定殘余的凝乳酶活力，以獲得最高凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

1.2.9 脫脂乳濃度對凝乳酶活力的影響分別調整脫脂乳的濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/100 ml，測定酶液在不同濃度脫脂乳液中的凝乳活力，以獲得的最高凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

1.2.10 金屬離子對凝乳酶活力的影響在脫脂乳中分別加入MnSO4、MgSO4、CuSO4、KCl、NaCl、SnCl2，使其終濃度為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L，加酶后在室溫下放置40min，測定凝乳酶活力，以未添加金屬離子酶液的凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

2 結果與分析

2.1 反應溫度對凝乳酶活力的影響（見圖1）

圖1 反應溫度對凝乳酶活力的影響

從圖1可以看出，隨著溫度的升高，相對凝乳酶活力逐漸增加，溫度達75℃時，相對凝乳酶活力達到最高值837.20%，隨著溫度的進一步升高，相對凝乳酶活力急劇下降，在80℃時降為91.98%，在85℃時，酶蛋白完全變性，已無凝乳酶活力。所以，凝乳酶的最適溫度是75℃，隨著溫度的升高，活力逐漸減低直至失活。

2.2 凝乳酶的熱穩定性（見圖2）

圖2 凝乳酶的熱穩定性

從圖2可以看出，在55℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸增大，當保溫30min時，相對凝乳酶活力達到最大值218.22%，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸下降，保溫60 min時相對凝乳酶活力最低；在65℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸增大，當保溫10min時，相對凝乳酶活力達到最大值181.41%，之后隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸下降，保溫60 min時降到最低；在70℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力持續下降，保溫20 min時，凝乳酶完全失活；在35℃～45℃，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力緩慢增大且較穩定。綜上所述，凝乳酶在35℃～45℃穩定性較好。

2.3 pH值對凝乳酶活力的影響（見圖3）

圖3 pH值對凝乳酶活力的影響

由圖3可以看出，隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力先增大，pH值為6.0時，相對凝乳酶活力達最大值100%。之后，隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力下降。有研究顯示，酸性環境對凝乳酶起促進作用的原因是pH值降低，導致酪蛋白疏水性增加，膠束易發生解離，從而促進酪蛋白聚集產生凝乳[8]。由上可知，凝乳酶的最適pH值為6.0。

2.4 凝乳酶的pH穩定性（見圖4）

圖4 不同pH值下凝乳酶的穩定性

由圖4可以看出，隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力逐漸增大，當pH值為8.5時，相對凝乳酶活力達到最大值100.04%，之后隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力逐漸下降。在pH值為7.0～10.0時，凝乳活力能保持在80%以上。

2.5 脫脂乳濃度對凝乳酶活力的影響（見圖5）

由圖5可以看出，隨著脫脂乳濃度的增加，凝乳酶活力迅速增大，當脫脂乳濃度達10.0%時，相對凝乳酶活力達99.17%，之后趨于穩定，只有小幅度增加，脫脂乳濃度為20.0%時，凝乳酶活力達到最大值，為100%。

2.6 金屬離子對凝乳酶活性的影響（見圖6）

由圖6可知，一定濃度的Mn2+、Mg2+、Na+對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，其中Na+對凝乳酶的凝乳活力有顯著的促進作用，K+、Sn2+、Cu2+對凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。高巖等[9]研究表明，Mn2+、Mg2+、Ca2+對該酶的凝乳活力有明顯的促進作用，而Zn2+、Cu2+對其凝乳活力有抑制作用。

圖5 脫脂乳濃度對凝乳酶活性的影響

圖6 金屬離子對凝乳酶活性的影響

3 結論

研究表明，米黑毛霉凝乳酶最適反應溫度為75℃；在35℃～45℃時凝乳酶熱穩定性較好，70℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸下降，到20 min時完全失活；米黑毛霉凝乳酶的最適pH值為6.0，在pH值為7.0～10.0時，凝乳酶較穩定；脫脂乳濃度為20.0%時，凝乳酶活力達到最大值；Mn2+、Mg2+、Na+對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，其中Na+對凝乳酶的凝乳活力有顯著的促進作用，K+、Sn2+、Cu2+對凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。

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[4]高維東，甘伯中，丁福軍，等.微小毛霉凝乳酶的酶學性質研究[J].食品科學，2010，31（3）：185-188.

[5]潘道東，韓玲玲.根霉凝乳酶的分離純化及其酶學特性研究[J].中國食品學報，2011，11（2）：53-58.

[6]Arima K，Shiniter I，Gakuzo T.Milk-clott ing enzymes from microorganism.part I：screening test and identification of potent fungus[J].Agricultural and Biologi cal Chemistry，1967，31（5）：540-545.

[7]錢世鈞，張純青.微小毛霉凝乳酶的純化和性質研究[J].微生物學報，1989，29（4）：272－277.

[8]薛璐，陳歷俊，姜鐵民，等.江米酒凝乳酶酶學特性的研究[J].食品科學，2008，29（4）：259-262.

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（*通訊作者：張衛兵）

G424.31

B

1671-1246（2017）13-0105-03

注：本文系甘肅省自然基金（1606RJZA079）；國家自然科學基金項目（31560442）；甘肅農業大學青年導師扶持基金（GAU-QNDS-201502）