HPLC法同時(shí)測(cè)定梔子金花分散片中7種成分的含量Δ

肖婭，李晶，常金花，陳威，劉翠哲，劉喜綱（河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000）

HPLC法同時(shí)測(cè)定梔子金花分散片中7種成分的含量Δ

肖婭＊，李晶，常金花，陳威，劉翠哲，劉喜綱#（河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德067000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定梔子金花分散片中梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Dimonsil C18，流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.032 3～0.323μg（r＝0.999 8）、0.137 4～1.374μg（r＝0.999 9）、0.003 72～0.037 2μg（r＝0.999 7）、0.006 9～0.069μg（r＝0.999 5）、0.003 32～0.033 2μg（r＝0.999 7）、0.008 64～0.086 4μg（r＝0.999 7）、0.001 22～0.012 2μg（r＝0.999 5）；定量限分別為0.032 1、0.137 4、0.003 72、0.006 7、0.003 30、0.008 64、0.001 22μg，檢測(cè)限分別為0.009 5、0.004 1、0.001 2、0.002 0、0.001 0、0.002 6、0.000 3μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3%；加樣回收率分別為96.54%～99.52%（RSD＝1.17%，n＝6）、97.23%～101.23%（RSD＝1.36%，n＝6）、97.22%～101.25%（RSD＝1.83%，n＝6）、97.32%～100.23%（RSD＝1.09%，n＝6）、97.99%～102.71%（RSD＝1.73%，n＝6）、96.99%～100.23%（RSD＝1.21%，n＝6）、96.99%～103.01%（RSD＝2.31%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定梔子金花分散片中7種成分的含量。

高效液相色譜法；梔子金花分散片；梔子苷；黃芩苷；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；含量

梔子金花分散片是由梔子金花丸劑型改進(jìn)而成，由梔子、黃連、黃芩、黃柏、大黃、金銀花、知母、天花粉等8味中藥組成[1-4]，收載于2015年《中國(guó)藥典》（一部）[5]，具有清熱瀉火、涼血解毒的功效。本課題組前期將方中藥物提取后，加入輔料制成梔子金花分散片[6-7]，由于分散片中有效成分較多，為了更好地控制其質(zhì)量，需建立該制劑中多種有效成分的含量測(cè)定方法。因此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定該制劑中7種有效成分的方法，以期為完善梔子金花分散片的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、EZChrom色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化公司）；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠）；ZDY-8型重型單沖壓片機(jī)（上海遠(yuǎn)東制藥機(jī)械總廠）；JA-2003型電子天平（北京精科電子天平）；AG-254型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DT5-6型高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心有限公司）；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100W，頻率：40 kHz）；XY-500A型高速多功能粉粹機(jī)（浙江省永康市松青五合金工具廠）；M illi-Q Adrantage A10型超純水儀（美國(guó)M illipore公司）。

1.2 藥品與試劑

梔子金花分散片（河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所自制，批號(hào)：20140401、20140402、20140403，規(guī)格：0.5 g/片）；梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-201115，純度：99.7%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201117，純度：91.7%）、蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-201308，純度：97.8%）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-200206，純度：＞98%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110、純度：＞98%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201319，純度：99.6%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201415，純度：99.1%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DimonsilC18（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～18m in，25%A；18～20min，25%→35%A；20～30m in，35%A；30～50 m in，35%→60%A；50～55 m in，60%→80%A；55～80m in，80%A）；流速：0.8m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL[8]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液精密稱取梔子苷對(duì)照品3.23 mg，置于10m L量瓶中；黃芩苷對(duì)照品6.87mg，置于10 m L量瓶中；蘆薈大黃素對(duì)照品4.65mg，置于25m L量瓶中；大黃酸對(duì)照品3.45mg，置于50m L量瓶中；大黃素對(duì)照品4.15mg，置于25m L量瓶中；大黃酚對(duì)照品2.16 mg，置于25m L量瓶中；大黃素甲醚對(duì)照品2.03mg，置于100m L量瓶中，均加甲醇適量，超聲處理40m in使溶解，放冷至室溫，加甲醇定容，制成單一對(duì)照品貯備液。精密量取上述梔子苷對(duì)照品貯備液5m L，黃芩苷對(duì)照品貯備液10m L，蘆薈大黃素對(duì)照品貯備液1m L，大黃酸對(duì)照品貯備液5m L，大黃素對(duì)照品貯備液1m L，大黃酚對(duì)照品貯備液5m L，大黃素甲醚對(duì)照品貯備液3m L，置于同一100m L量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得。

2.2.2 供試品溶液精密稱取樣品細(xì)粉約0.20 g，置于10m L量瓶中，加70%甲醇溶液適量，超聲處理40m in，放冷至室溫，加70%甲醇溶液定容，以半徑5 cm、13 000 r/m in離心15m in，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液按樣品的處方比例及工藝制備不含梔子、黃芩、大黃總蒽醌的陰性對(duì)照樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，理論板數(shù)以梔子苷峰計(jì)為5 000，保留時(shí)間為18.3m in；各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，結(jié)果表明其他成分對(duì)測(cè)定不干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

2.4 線性關(guān)系考察

分別量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L，分別置于10m L量瓶中，加70%甲醇溶液定容，即得系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果，梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的LOQ分別為0.032 1、0.137 4、0.003 72、0.006 7、0.003 30、0.008 64、0.001 22μg，LOD分別為0.009 5、0.004 1、0.001 2、0.002 0、0.001 0、0.002 6、0.000 3μg。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.40%、0.32%、0.81%、0.47%、1.42%、0.30%、2.47%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140401）適量，分別于室溫下放置0、3、5、6、8、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.40%、0.46%、1.89%、0.60%、0.53%、0.44%、1.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140401）細(xì)粉適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各待測(cè)成分含量。結(jié)果，梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的平均值分別為17.60、72.40、2.26、4.78、0.98、1.36、0.35 mg/g，RSD分別為2.69%、1.41%、2.51%、2.50%、1.60%、2.68%、1.86%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140401）細(xì)粉適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品細(xì)粉各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各待測(cè)成分的含量，詳見表3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本課題組考察了不同的流動(dòng)相[甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.5%冰乙酸、甲醇-水-冰醋酸]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.5%冰乙酸、甲醇-水-冰醋酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)色譜基線不穩(wěn)，而選擇甲醇-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜的峰形和分離度均較好[9]。因此，選擇上述溶液為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝6）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，m g/g）Tab 3 Results of contents determ ination of sam p les（n＝3，m g/g）

3.2 提取溶劑和超聲時(shí)間的選擇

本試驗(yàn)對(duì)比了甲醇、乙醇、70%甲醇溶液、70%乙醇溶液作為提取溶劑的回收率，發(fā)現(xiàn)采用70%甲醇溶液為提取溶劑時(shí)，回收率較好。又考察了不同的超聲時(shí)間（20、40、60min）對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明，超聲處理40min可將樣品中的梔子苷、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚提取完全。因此，本試驗(yàn)選擇提取溶劑為70%甲醇溶液，超聲處理時(shí)間為40 m in。

3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

為了方便分析，筆者選擇在同一波長(zhǎng)下測(cè)定各待測(cè)成分，參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]中各待測(cè)成分的波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在254 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，梔子苷和黃芩苷的最大吸收雖然不在254 nm，但二者在制劑中含量比較高，采用254 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)能夠達(dá)到方法學(xué)考察的要求。因此，選擇254 nm作為本試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定梔子金花分散片中7種成分的含量。

[1]陳曉虎，蘇晶，王慧，等.UPLC法同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中11種成分[J].中草藥，2014，45（7）：955-959.

[2]趙倩，馮偉紅，張啟偉，等.“一測(cè)多評(píng)”法用于梔子金花丸多成分含量測(cè)定的可行性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（10）：1826-1833.

[3]郝乘儀，郭淑英，朱鶴云，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中9個(gè)成分的含量[J].藥物分析雜志，2014，34（9）：1571-1575.

[4]王曉可，毋福海.梔子金花丸中梔子苷含量的膠束毛細(xì)管電泳法測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（9）：2084-2086.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1165.

[6]趙文普，崔英慧，劉喜綱，等.梔子金花分散片的制備[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（8）：584-587.

[7]陳威，趙東鳳，史紅娟，等.HPLC法測(cè)定梔子金花分散片中鹽酸小檗堿的含量[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31（1）：17-19.

[8]陳威，尹長(zhǎng)江，劉翠哲，等.測(cè)定梔子金花丸中3種成分的含量及梔子苷的溶出度[J].天津藥學(xué)，2015，27（3）：4-6.

[9]劉喜綱，常金花，王汝興，等.大黃總蒽醌的提取精制工藝研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（15）：1366-1371.

[10]楊璐璐，秦學(xué)玲，彭靜，等.HPLC法測(cè)定中藥愈傷便捷濕巾藥液中梔子苷的含量[J].中國(guó)藥房，2015，26（33）：4701-4703.

[11]章運(yùn)典，周里欣，陳洪英.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷[J].中成藥，2014，36（8）：1670-1673.

[12]吳茵，穆華，劉勇，等.UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定玄麥甘桔顆粒中8種有效成分[J].中草藥，2015，46（20）：3034-3038.

[13]李想，盧靜華.HPLC法同時(shí)測(cè)定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和黃芩苷[J].中成藥，2015，37（9）：1955-1958.

[14]孫永慧，李文春.HPLC同時(shí)測(cè)定雙黃連粉針劑中5種成分的含量[J].中成藥，2010，32（1）：65-68.

Simultaneous Determ ination of 7 Components in Zhizi Jinhua Dispersible Tabletsby HPLC

XIAO Ya，LI Jing，CHANG Jinhua，CHEN Wei，LIU Cuizhe，LIU Xigang（Hebei Provincial Key Laboratory of Research and Development for TCM/Institute of TCM Research，Chengde Medical College，Hebei Chengde067000，China）

HPLC；Zhizi jinhua dispersible tablets；Geniposide；Baicalin；A loe-emodin；Rhein；Emodin；Chrysophanol；Physcion；Content

R 917

A

1001-0408（2017）18-2549-05

2016-08-12

2016-12-21）

（編輯：劉柳）

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No. QN2014145）；河北省高校省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科（No.冀教高〔2013〕4號(hào)）；承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.201021020）

＊碩士研究生。研究方向：中藥制劑現(xiàn)代化。電話：0314-2290629。E-mail：1391959216@qq.com

#通信作者：副教授，碩士。研究方向：中藥制劑現(xiàn)代化。電話：0314-2290629。E-mail：liuxgmail@sina.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.29

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop amethod for simultaneous determ ination of geniposide，baicalin，aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion in Zhizi jinhua dispersible tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Dimonsil C18column w ith mobile phase consisted ofmethanol-0.05%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 0.8m L/min.The detection wavelength was set at 254 nm，and the column temperaturewas 25℃.The sample size was 20μL. RESULTS：The linear ranges of geniposide，baicalin，aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion were 0.032 3-0.323μg（r＝0.999 8），0.137 4-1.374μg（r＝0.999 9），0.003 72-0.037 2μg（r＝0.999 7），0.006 9-0.069μg（r＝0.999 5），0.003 32-0.033 2μg（r＝0.999 7），0.008 64-0.086 4μg（r＝0.999 7）and 0.001 22-0.012 2μg（r＝0.999 5），respectively.The limits of quantitation were 0.032 1，0.137 4，0.003 72，0.006 7，0.003 30，0.008 64，0.001 22μg，respectively.The limits of detection were 0.009 5，0.004 1，0.001 2，0.002 0，0.001 0，0.002 6，0.000 3μg，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3%.The average recoveries were 96.54%-99.52%（RSD＝1.17%，n＝6），97.23%-101.23%（RSD＝1.36%，n＝6），97.22%-101.25%（RSD＝1.83%，n＝6），97.32%-100.23%（RSD＝1.09%，n＝6），97.99%-102.71%（RSD＝1.73%，n＝6），96.99%-100.23%（RSD＝1.21%，n＝6），96.99%-103.01%（RSD＝2.31%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：Themethods is simple and reproducible.It can be used for the content determination of 7 components in Zhizi jinhua dispersible tablets.