肺泡灌洗液二代基因測序在鸚鵡熱衣原體感染肺炎診斷中的應用

周柳如，方錦龍，張平

東莞市人民醫院 呼吸與危重癥醫學科，廣東 東莞 523000

0 引言

鸚鵡熱衣原體屬于一種嚴格胞內寄生的需氧革蘭陰性菌，是介于細菌與病毒之間的特殊病原微生物，宿主主要是鳥類、家禽、家畜等，可經密切接觸、氣溶膠途徑發生人畜傳染[1]。鸚鵡熱衣原體感染人體后最常累及的臟器是肺部，但由于鸚鵡熱衣原體所致肺炎較為罕見，臨床仍缺乏快速、精準的診斷手段。二代基因測序（NGS）技術為近年新興的一種DNA/RNA檢測技術，具有檢測速度快、靈敏度高等優點，適用于重癥或疑難病例病原學鑒別診斷[2]。但關于NGS技術應用于鸚鵡熱衣原體感染肺炎診斷中的相關報道較少。鑒于此，本研究對我院收治的13例鸚鵡熱衣原體感染肺炎患者的肺泡灌洗液進行NGS檢測，分析NGS技術對鸚鵡熱衣原體感染肺炎的診斷價值，旨在為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年3月-2021年4月東莞市人民醫院收治的13例鸚鵡熱衣原體感染肺炎患者作為研究對象，13例患者中男10例，女3例；年齡45～81歲，平均（62.98±7.07）歲；10例患者有家禽接觸史，包括3例接觸雞鴨，4例接觸鴿子，3例接觸其他鳥類，剩余3例接觸史不明確；基礎疾病史：7例合并冠心病，6例合并高血壓，5例合并2型糖尿病，2例合并慢性乙肝，6例合并房顫。本研究已獲得醫院醫學倫理委員會審批。

納入標準：①符合鸚鵡熱衣原體肺炎的診斷標準[3]，有咳嗽、咳痰、呼吸困難等臨床表現；②在呼吸道樣本中檢測到鸚鵡熱衣原體病原微生物，或微免疫熒光實驗檢測到抗鸚鵡熱衣原體IgM抗體滴度1∶16；③患者自愿接受檢查，簽訂了知情同意書。排除標準：①伴有其他肺部疾病；②不配合樣本采集者。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液NGS技術檢測

①肺泡灌洗液采集：在局麻下行支氣管肺泡灌洗術。即置入纖維支氣管鏡，將其嵌于肺葉目的片段，往肺內注入溫的滅菌生理鹽水20mL，再負壓抽吸10mL灌洗液到無菌專用容器中送檢；②檢測：應用BGISEQ-100平臺（深圳華大基因股份有限公司）進行NGS檢測，具體方法：a.DNA提取：取3mL肺泡灌洗液，經玻璃珠混合震蕩后使用TIANamp Mico DNA Kit試劑盒[DP316，天根生化科技（北京）有限公司]，嚴格按照試劑盒說明書提取DNA。b.構建文庫和測序：取提取所得的DNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段大小，使用QubitdsDNA Hs Assay Kit（Thermo Fisher Scienti6c Inc.）質控DNA文庫濃度，經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制生成DNA納米球。制備好的DNA納米球加載到測序芯片，使用BGISEQ-50進行測序。c.數據分析：獲得測序數據后將長度小于35bp、低質量的數據去除以獲得高質量的數據。應用BWA軟件將測序所得的病原序列與病原庫進行對比，然后再去宿主化扣除正常人群中出現的微生物群落背景，來找到所檢測臨床標本中可能致病的微生物。結果判斷：NGS檢測得到的微生物讀數，至少比其他微生物高2倍，則鑒定的微生物被分類為確認的病原體。

1.2.2 肺泡灌洗液傳統病原檢測

取“1.2.1”步驟中10mL肺泡灌洗液，應用德國布魯克質譜儀進行鑒定，使用法國生物梅里埃公司ⅥIEK-2、美國BD公司M-50法國生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀，美國BD公司M-50自動微生物鑒定和藥敏分析系統。進行細菌生化鑒定和藥敏試驗。

1.2.3 痰液NGS檢測

指導患者深呼吸用力咳嗽，將咳出的痰液保存到無菌容器內送檢。NGS檢測方法與“1.2.1”相同。

1.3 觀察指標

①比較肺泡灌洗液NGS、肺泡灌洗液傳統病原測定、痰樣本NGS檢測鸚鵡熱衣原體的陽性率。②比較三種檢測方法的結果回報耗時。③隨訪記錄13例患者的預后轉歸情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料用（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同檢測方法的檢測結果比較

肺泡灌洗液NGS對鸚鵡熱衣原體的陽性檢出率顯著高于傳統病原測定和痰樣本NGS（χ2=9.370，P=0.009），見表1。

表1 不同檢測方法的檢測結果[n(%)]

2.2 不同檢測方法的結果回報耗時比較

肺泡灌洗液NGS、痰樣本NGS的檢測結果回報耗時顯著短于傳統病原測定（P＜0.05），見表2。

表2 不同檢測方法檢測所需時間比較

2.3 預后轉歸情況

13例患者確診為鸚鵡熱衣原體感染后，11例予以多西環素治療，2例采用莫西沙星治療，并根據藥敏試驗經驗性配合其他抗生素。經氧療、藥物抗感染、呼吸支持等處理后，11例患者病情明顯好轉出院，2例治療無效，這考慮為患者伴有其他并發癥。其中1例患者因伴有大面積腦梗死，家人放棄治療辦理出院。另1例患者伴有多種基礎疾病，基礎狀態較差，住院期間反復發熱，合并膿毒血癥，呼吸循環功能衰竭，最終導致死亡。

3 討論

最早于1879年歐洲就首次報道了人類可感染鸚鵡熱衣原體，鸚鵡熱主要是指感染鸚鵡熱衣原體而導致的人畜共患病，人類通過接觸鳥類的尿液、糞便或其他排泄物或通過氣溶膠途徑可傳播感染，進展成流感樣疾病、肺炎[4]。實際上，鸚鵡熱在臨床中并不常見，而且有調查數據顯示，亞洲國家鸚鵡熱患病率顯著低于澳大利亞、歐洲[5]。另由于本病診斷缺乏敏感性、特異性較高的檢測方法，具體流行病學特征尚未明確。

人體感染鸚鵡熱衣原體后，主要累及肺部，臨床表現為發熱惡寒、干咳、頭痛、咽喉疼痛等非特異性的流感癥狀，病情嚴重的可發展為重癥肺炎，發生意識模糊、呼吸困難等。因此，從癥狀體征來看，鸚鵡熱衣原體感染肺炎缺乏特異性癥狀，臨床診斷較難。在影像學診斷方面的特異性也不高，有研究報道[6]，鸚鵡熱衣原體肺炎患者中有90%病例的肺部X線片可見異常，肺內出現不同程度滲出和實質性病變，與其他類型肺炎無明顯的差異。

當前臨床診斷鸚鵡熱主要通過臨床表現、鳥類接觸史進行初步疾病診斷，但在實際臨床中部分患者并沒有鳥類接觸史，極易引起了漏診、誤診。而本病確診方法為傳統微生物檢測，主要是通過涂片鏡檢、微生物培養法、PCR擴增等方法鑒別采集的樣本中的病原種類及其定量信息，但該法耗時相對較長（一般需要5～7天），且結果極易受抗菌藥物使用所影響，存有一定的局限性[7]。另有文獻指出[8]，鸚鵡熱衣原體的分離、培養效率較低，傳統病原學測定陰性概率較大，不利于診治。隨著醫學檢測技術的進步，為了提高病原微生物檢測的效率及其精確度，二代基因測序技術應運而生。二代基因測序技術主要是通過對宏基因組的樣本開展大規模測序，以獲得基因組核酸序列，再借助生物信息工具進行定量分析，獲得詳細的病原基因信息[9]。也有研究證實[10]，二代基因測序技術具有無培養樣本、檢測時間短、測定靈敏度高、可測定未知病原體等優點，能夠彌補傳統微生物檢測的不足之處，為臨床疾病診治提供新的可靠依據。本研究將二代基因測序技術應用于鸚鵡熱衣原體感染肺炎診斷中，結果發現，無論是應用肺泡灌洗液還是痰樣本，應用二代基因測序技術所需耗時均短于傳統病原學測定，提示應用NGS測序技術檢測報告快，能夠顯著降低診斷時間，利于臨床及時早期治療。

此外，本研究還對不同呼吸道樣本的NGS檢測及傳統病原學測定效果進行分析，結果發現，肺泡灌洗液、痰樣本NGS測定的陽性率顯著高于傳統病原測定，說明NGS技術的檢測優勢優于傳統病原學。而且肺泡灌洗液NGS的陽性率優于痰樣本，這是因為肺泡灌洗液沒有口腔、上呼吸道定植菌的干擾[11]。因此，應用肺泡灌洗液進行NGS檢測對鸚鵡熱具有較高的診斷價值。

鸚鵡熱衣原體為衣原體科病原微生物，主要應用抑制致病菌DNA、蛋白質合成的抗菌藥物，如四環素類（如多西環素等）、大環內酯類抗生素（如莫西沙星等）[12-13]。本研究中13例患者經NGS測定發現為鸚鵡熱衣原體所致肺炎后，及時調整治療方案，11例采用多西環素治療，2例采用莫西沙星治療，結果11例患者病情好轉出院，另2例因伴有其他系統并嚴重并發癥而自動放棄救治或死亡，提示NGS技術檢測能夠快速明確疾病診斷，最大限度縮短了患者病程，利于有效改善患者的預后，也可減少后續非必要的治療費用，能夠在一定程度上抵消NGS檢測費用高的問題，同時還可以減少不必要抗菌藥物應用，避免耐藥現象。

綜上所述，與傳統病原學檢測相比，應用肺泡灌洗液NGS對鸚鵡熱衣原體感染肺炎有更高的檢出率，且其檢測耗時短，利于臨床早期、準確診治，有效改善患者的預后。但本研究納入病例數較少，只有13例肺泡灌洗液進行NGS檢測，今后研究仍需擴大樣本量，延長隨訪時間以進一步驗證結論。