1株嗜熱性羽毛降解菌的分離鑒定及其酶學性質

劉艷海+姚大偉+劉建新+楊德吉

摘要：為從環境中得到1株嗜熱高效角蛋白降解菌，用以羽毛粉為唯一碳源、氮源的培養基進行篩選。經篩選得到1株嗜熱降解羽毛角蛋白的Y6菌株，通過對該菌株菌落、菌體形態特征、生理生化特性測定和16S rRNA分析，使用美國國立生物技術信息中心（NCBI）的BLAST進行16S rRNA的相似性比對。相似性比對結果顯示，Y6菌株與地衣芽孢桿菌Xmb047（Bacillus licheniformis Xmb047）的同源性99%，初步認定該菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），命名為Y6（GenBank登陸號KY082766）。采用該菌降解完整羽毛，發酵72 h后，完整羽毛僅剩下羽軸，羽枝被完全降解，說明Y6菌株有著較強的羽毛降解能力；用不同濃度硫酸銨溶液鹽析發酵產物上清液，篩選出硫酸銨濃度為70%時，分離的粗酶液總活性最高。酶活性試驗表明，Y6所產蛋白酶最適反應溫度為70 ℃，最適pH值為8.0，Fe3+、Zn2+對蛋白酶活性有較強的抑制作用，陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）、金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸（EDTA）能較強地抑制蛋白酶活性，表明該蛋白酶屬于金屬蛋白酶。

關鍵詞：嗜熱性角蛋白降解菌；角蛋白酶；羽毛角蛋白；地衣芽孢桿菌Y6；酶學性質

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0232-06

近年來，家禽產品的生產和消費呈全球化增長。羽毛是家禽屠宰后產生的廢棄物，且產量巨大，我國羽毛產量約為100萬t/年[1]。大量羽毛的廢棄不僅造成資源的巨大浪費，而且污染環境。羽毛粉中各類氨基酸齊全，含必需氨基酸，特別是含硫氨基酸含量較高。因此對這類資源加以充分利用將是蛋白飼料非常重要的補充[2]。

雖然角蛋白類廢棄物富含氨基酸，是飼料蛋白潛在而巨大的來源，但消化率非常低。如果能提高角蛋白類廢棄物的利用率，不但可為養殖業提供大量的飼料蛋白，而且能帶動所有角蛋白類廢棄物的收集和加工產業鏈的發展，從而對這些廢棄物的資源化利用和減排有積極的意義，減輕對環境造成的污染[3-4]。

筆者所在研究室已經從某些特別動物的胃腸道中分離得到100多株能降解角蛋白的微生物，如蘇云金芽孢桿菌NJY1，短小芽孢桿菌NJK4、NJQ2和蠟樣芽孢桿菌NJQ3等，在實驗室試驗和中試試驗中都表明，它們單獨或聯合進行固體發酵，羽毛粉的降解率能達到80%，降解產物體外消化率達85%[5-6]。但是，這些微生物的應用也有缺點：最佳發酵溫度在37 ℃，降解速度較慢，正常1個周期需要6～7 d才能充分降解。因此，對于規模化生產，設備周轉慢、投資量大，這是制約菌株工業化發酵的重要條件[7]。為了分離1株高效耐高溫的羽毛角蛋白降解菌，筆者從云南騰沖熱泉水中取樣，經過富集培養，采用以羽毛粉為唯一碳源、氮源的培養基進行篩選，以期為進一步研究羽毛粉的微生物發酵奠定基礎。

1材料與方法

1.1樣品采集

樣品采集自云南騰沖熱泉水。

1.2培養基

營養培養基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g氯化鈉，補足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.0；營養瓊脂培養基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g氯化鈉，15.0 g 瓊脂粉，補足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.0；篩選培養基：15.0 g羽毛粉，0.5 g NaCl，0.01 g CaCl2，0.4 g MgSO4·7H2O，0.35 g KH2PO4，0.7 g K2HPO4，15.0 g瓊脂粉，補足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.0；種子培養基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g氯化鈉，補足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.5；發酵培養基：15.0 g羽毛粉，0.5 g NaCl，0.01 g CaCl2，0.4 g MgSO4·7H2O，0.35 g KH2PO4，0.7 g K2HPO4，補足蒸餾水至1 000 mL，pH值7.5。

1.3增殖培養

量取1 mL采集的樣品于營養培養基中，55 ℃、150 r/min培養24 h。

1.4篩選

取營養培養基中的菌液100 μL，涂布于篩選培養基平板，55 ℃培養24 h。挑選生長良好的單菌落，重新劃線篩選培養基平板，純培養，保種備用。

1.5細菌鑒定

1.5.1菌落及菌體形態觀察將分離純化的菌株劃線接種于營養瓊脂培養基平板上，55 ℃培養24 h。肉眼觀察菌落的形狀、顏色、表面質地以及菌落邊緣。經革蘭氏染色后于光學顯微鏡及電鏡下觀察菌體形態。

1.5.2菌株生長溫度范圍測定將100 μL純培養得到的菌液接種到裝有3 mL營養培養基的試管中，分別于35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴培養12 h。通過測定培養液中的D600 nm來確定其生長溫度范圍及最適生長溫度。

1.5.3菌株生長pH值范圍測定將純培養得到的100 μL菌液分別接種到pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、90、9.5、10.0的3 mL營養培養基中，55 ℃培養12 h。通過測定培養液中的D600 nm來確定其生長pH值范圍及最適生長pH值。

1.5.4生理生化特性的鑒定參照文獻[8]對該菌株的生理生化特性進行鑒定。

1.5.516S rRNA分析吸取1 mL過夜培養的菌液，98 ℃金屬浴10 min，金屬浴后，將溶液于13 000 r/min離心3 min，吸取5 μL作為PCR擴增模板。采用16S rRNA基因的通用引物[9]配成 50 μL 體系進行PCR反應。上游引物（1492R）：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，下游引物（8F）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，測序結果與GenBank中已發表的基因序列進行同源性比較。

1.5.6系統進化樹的構建與分析用BLASTn程序在GenBank中進行相似性對比，選取相似性較大的序列用Mega 5.0進行系統發育分析，用鄰接法（Neighbor-Joining，簡稱N-J）構建系統進化樹[8]。

1.6羽毛降解能力測定

將篩選得到的純化菌株分別接種至種子培養基中，55 ℃、150 r/min培養過夜。將種子液分別接種至裝有50 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，55 ℃、150 r/min培養，觀察羽毛降解情況。

1.7粗酶的制備

從羽毛粉培養基平板挑選單個菌落接種至種子培養基上，55 ℃搖床培養過夜。按照10%的接種量接種羽毛粉發酵培養基，在55 ℃的條件下，在搖床上以150 r/min的轉速培養72 h，取發酵液，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液。

去上述上清液分別加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別達10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，室溫下靜置 24 h，8 000 r/min離心20 min棄去上清液，沉淀用0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶解至原體積的1/10。隨后對蛋白酶活性進行測定。選擇合適的硫酸銨濃度，鹽析后沉淀采用 1/10 原體積的0.2 mol/L PBS溶解，裝入透析袋中，然后置于4 ℃，用去離子水透析24 h，透析袋中即為粗酶液。

1.8粗酶蛋白酶酶學性質的研究

1.8.1蛋白酶活性的測定參照Folin試劑顯色法[10]，略有改動。取上述粗酶液1 mL，置于60 ℃水浴中預熱2 min，再加入經同樣預熱的1 mL 2%酪蛋白溶液，精確保溫30 min；時間到后，立即加入2 mL 0.4 mol三氯乙酸以終止反應，繼續置于水浴中保溫20 min，使殘余蛋白質沉淀后離心。取1 mL離心后的上清液，加入5 mL 0.4 mol/L碳酸鈉溶液、1 mL已稀釋的福林試劑，搖勻，40 ℃保溫發色20 min后進行吸光度（D660 nm）測定。酶活單位：在40 ℃下1 min水解酪蛋白產生 1 μg 酪氨酸，定義為1個蛋白酶活性單位。

1.8.2溫度對酶活性的影響將粗酶液、酪蛋白混合后的反應液分別置于40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴中反應 30 min，測定蛋白酶活性。

1.8.3酶的熱穩定性以酪蛋白為底物，將粗酶液置于不同溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）中水浴處理，每20 min測定蛋白酶活性，研究不同溫度對蛋白酶穩定性的影響。

1.8.4酶的最適作用pH值采用不同pH值6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-鹽酸緩沖液和pH值9.4、10.0的硼砂-氫氧化鈉緩沖液配制2%酪蛋白底物，測定粗酶液的最適作用pH值。

1.8.5激活劑、抑制劑等不同試劑對酶活性的影響為研究激活劑、抑制劑對酶活性的影響，向酶液中加入不同的抑制劑、激活劑、表面活性劑、還原劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tween-80、苯甲基磺酰氟（PMSF）、TritonX-100、異丙醇、甘油和二甲基亞砜（DMSO）等，使各種試劑終濃度為5%，60 ℃下作用30 min，分析殘余酶活性。以去離子水代替修飾劑，在相同條件下測定酶活性，將此酶活性視為100%。

1.8.6金屬離子對酶活性的影響分別將含有0.1 mol/L [JP3]Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+的200 μL 0.05 mol/L、pH值7.5的Tirs-HCl緩沖液與1.8 mL粗酶液混合，使反應體系中金屬離子的濃度達到10 mmol/L，60 ℃作用30 min，分析殘余酶活性。以去離子水代替代替修飾劑，在相同條件下測定酶活性，將此酶活性視為100%。

2結果與分析

2.1菌株篩選

在以羽毛為唯一碳源和氮源的培養基上，經過多次傳代，分離到純的菌株，命名為Y6。

2.2菌體、菌落形態特征

Y6為革蘭氏陽性芽孢桿菌（圖1），大小約（0.5～2.5）μm×（1.2～10.0）μm，電子顯微鏡測量其大小為0.5 μm×2.0 μm（圖2）。Y6在普通營養瓊脂平板上，于 55 ℃ 恒溫培養12 h，菌落呈乳白色，圓盤狀，邊緣整齊或不整齊，表面光滑，有微皺褶突起，不透明（圖3）。

2.3生長溫度范圍及生長pH值范圍

將菌株置于不同溫度、pH值下培養，12 h后使用分光光度計測定菌液的D600 nm，以空白營養培養基作為對照。如圖4所示，培養溫度對Y6菌株的生長有著明顯的影響，在所選溫度范圍內，菌體密度隨溫度的差異而變化，當培養溫度低于37 ℃時，菌體生長緩慢；當培養溫度在45～60 ℃之間時，菌體生長情況較好，且菌體的最適培養溫度為55 ℃，屬于嗜熱菌。如圖5所示，在pH值7.0～9.0時，菌體生物量較大，最適生長pH值為7.5。本試驗結果與晏愛芬等分離的嗜熱地衣性芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）NHH4最適生長溫度一致[11]，同時兩者都具有較寬的反應溫度范圍。

2.4Y6菌株的生理生化特性

由表1可見，Y6菌株甲基紅試驗呈陽性，伏-普（V-P）試驗呈陽性，吲哚試驗呈陰性；能利用丙二酸鹽、檸檬酸鹽；能水解酪蛋白、淀粉，不能水解明膠；葡萄糖產氣呈陰性，能利用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇；不能利用山梨醇、纖維二糖、半乳糖；反硝化作用呈陰性；硝酸鹽還原作用呈陽性；亞硝酸鹽還原作用呈陽性。由形態觀察及生理生化特征結果可以初步確定該菌株為芽孢桿菌屬。

2.5細菌16S rRNA基因分析

本研究分離的Y6菌株16S rRNA基因擴增電泳結果顯示，該菌基因約為1 400 bp（圖6）。該基因的GenBank登錄號為KY082766。使用美國國立生物技術信息中心（NCBI）的BLAST進行16S rRNA的相似性比對，結果顯示，該基因與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）strain Xmb047（GenBank登錄號：KT986173）的同源性99%。利用Mega5.0軟件進行多重序列比對，并繪制系統進化樹。如圖7所示，Y6菌株與地衣芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）PF1-3.1（GenBank登錄號：KT720020）的親緣關系最近，同源性較高。結合細菌形態學及生理生化特性鑒定，初步認定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Y6。

2.6羽毛降解效果

如圖8所示，與對照組相比，36 h時試驗組小羽開始掉落；隨著時間的推移，試驗組羽毛上的小羽逐漸降解，大約 72 h 時，小羽完全降解，僅剩下羽柄，而對照組的羽毛基本沒有變化。由此可知，Y6有較強的羽毛降解能力。

2.7硫酸銨飽和度對酶提取的影響

由圖9可以看出，隨著硫酸銨濃度的不斷增加，沉淀的蛋白酶活性也不斷增強（呈線性正相關），當硫酸銨濃度達70%時，沉淀中的蛋白酶活性占總蛋白酶活性的100%。為獲得較大的回收率，本試驗采用70%的硫酸銨鹽析沉淀蛋白酶。

2.8溫度對蛋白酶活性的影響

如圖10所示，該蛋白酶在40～70 ℃之間隨溫度升高，酶活性逐漸增大，且溫度高達80 ℃時酶活性為38.38 U/mL，最適溫度為60～80 ℃；70 ℃時，酶活性最高，為50.52 U/mL；高于90 ℃時，酶活性降低迅速。結果表明， 該蛋白酶為一種高溫型蛋白酶，該酶的最適反應溫度（70 ℃）高于Suntornsuk等報道的由B. licheniformis FK 14生產的熱穩定性角蛋白酶的最適溫度60 ℃，同時，兩者都具有較寬反應溫度范圍，在40～90 ℃ 范圍內均能保持較高的酶反應活性[12]。

如圖11所示所示，將粗酶液置于不同溫度中處理不同時間，用福林-酚法測定酶活性，粗酶在60～80 ℃之間，熱穩定

性較好，可見溫度相對低的情況對粗酶破壞較輕；在高溫條件下，酶活性下降迅速，100 ℃作用20 min，粗酶活性完全喪失。結果表明，該蛋白酶具有一定的耐熱性，屬于耐熱性蛋白酶。

2.9pH值對蛋白酶活性的影響

由圖12可知，角蛋白粗酶在不同pH值緩沖體系中，60 ℃ 下用福林-酚法測定角蛋白酶活性，該酶的最適pH值為7.5～8.5，當pH值為8.0時，酶活性達到最大值 50.24 U/mL，表明該角蛋白酶為堿性蛋白酶。Cheng等從地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）PWD-1中提取了1種蛋白酶，最適pH值為8.5[13]，比本試驗提取的蛋白酶稍微耐堿。

2.10不同試劑對酶活性的影響

如圖13所示，EDTA、SDS、Tween-80、PMSF和TritonX-100抑制了蛋白酶的活性，其中EDTA、SDS對蛋白酶有很強的抑制作用，其處理分別只能達到總酶活性的34%、49%；異丙醇、甘油和DMSO對蛋白酶活性幾乎沒有影響。

2.11金屬離子對酶活性的影響

如圖14所示，在金屬離子中，Zn2+、Fe3+對蛋白酶抑制作

用最強，其處理的酶活性分別僅為酶總活性的21%、18%；Mn2+能大幅度增強蛋白酶的活性，為總酶活性的1.95倍；其余離子如Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+對蛋白酶活性影響不大。

3討論

微生物降解羽毛角蛋白和產角蛋白酶的過程中，目前地衣芽孢桿菌是被研究最多的，也是被認為具有較強降解能力的芽孢桿菌屬。以美國北卡羅萊納州立大學的William等為代表，對地衣芽孢桿菌PWD-1（Bacillus licheniformis PWD-1）的降解能力、產酶特性、降解機制及分子生物學進行深入全面的研究[14-16]，也將地衣芽孢桿菌PWD-1的角蛋白酶基因KerA轉入枯草芽孢桿菌進行基因工程方面的研究[17-18]。國內外很少有嗜熱性菌株降解羽毛粉的研究，傅偉從土壤中分離出地衣芽孢桿菌ZJUQH（Bacillus licheniformis ZJUQH），并研究得出其最適發酵溫度為37 ℃[19]。本研究的菌株分離于云南騰沖熱海，是一種嗜熱性地衣芽孢桿菌。根據菌落形態、菌體形態特征、細菌生理生化特性、細菌16S rRNA基因分析，初步認為Y6為地衣芽孢桿菌屬。Y6最適生長溫度為55 ℃，此溫度下發酵羽毛粉能抑制環境中大部分雜菌的生長，大大提高了發酵效率。

角蛋白酶是一種十分重要的工業酶，廣泛應用于飼料、肥料、洗滌劑、皮革和制藥行業。但是在我國，角蛋白酶的品種和生產菌株都很單一。筆者分離的蛋白酶來源于嗜熱細菌地衣芽孢桿菌Y6（Bacillus licheniformis Y6），是一種嗜熱耐堿蛋白酶，在較高的溫度范圍（40～90 ℃）和較寬泛的pH值范圍（6.5～10.0）中均能發揮作用。EDTA、SDS強烈抑制該蛋白酶活性，說明該酶可能是一種金屬蛋白酶。抑制劑PMSF對該蛋白酶活性影響較小，PMSF為絲氨酸酶抑制劑，可能是由于絲氨酸不是該淀粉酶的活性中心。本研究以酪蛋白為底物，測定Y6所產蛋白酶的活性，酪蛋白水解活性測定是評測蛋白酶活性的標準方法，與使用不溶性的角蛋白或羽毛粉角質溶解活性測定相比，能夠提供準確的結果。菌株蛋白酶生產力由酪蛋白水解活性估計測定結果與角質溶解活性測定結果具有很好的相關性[20]。

角蛋白降解菌篩選的標準通常為產透明圈大小和觀察降解完整羽毛的能力[21]。由于Y6菌株最適生長溫度為55 ℃，該溫度下羽毛瓊脂培養基水分蒸發較快，透明圈還沒有完全形成，培養基已被蒸干，嚴重干擾試驗結果。因此，本試驗采用觀察降解完整羽毛的標準進行定性分析其降解能力，72 h后完整羽毛僅剩下羽軸，該菌無法徹底降解羽軸，其發酵條件的優化須進一步研究。

4結論

從云南騰沖熱泉水中取樣，經過富集培養，以羽毛粉為唯一碳源和氮源的培養基篩選，最終獲得1株嗜熱性羽毛降解菌，進一步通過16S rRNA測序，初步鑒定菌株Y6為地衣芽孢桿菌，暫時命名為地衣芽孢桿菌Y6（Bacillus licheniformis Y6）。在完整羽毛降解的試驗中發現，36 h時試驗組小羽開始掉落，大約72 h時，小羽完全降解，僅剩下羽柄，具有較強的降解羽毛的能力。

Bacillus licheniformis Y6所產蛋白酶是一種嗜熱耐堿蛋白酶，該酶的最適反應溫度、最適反應pH值分別為70 ℃、8.0。在測定金屬離子對蛋白酶活性的影響時，結果顯示，2價金屬離子Ba2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+沒有增強其蛋白酶的活性，說明該酶在催化反應過程中不需要Ba2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+金屬離子的參與，Fe3+、Zn2+對蛋白酶活性有較強的抑制作用。陰離子表面活性劑SDS對蛋白酶有較強的抑制作用，金屬蛋白酶抑制劑EDTA能較強地抑制蛋白酶的活性，表明該蛋白酶可能屬于金屬蛋白酶。3種有機溶劑DMSO、異丙醇、甘油對蛋白酶活性幾乎沒有影響，表明該蛋白酶在耐有機溶劑生物催化劑方面有潛在的應用前景，在洗滌工業生產中也有較大的應用價值。

參考文獻：

[1]Eslahi N，Dadashian F，Nejad N H. An investigation on keratin extraction from wool and feather waste by enzymatic hydrolysis[J]. Preparative Biochemistry & Biotechnology，2013，43（7）：624-648.

[2]王政，郭士兵，姚大偉，等. 高效降解角蛋白菌株的分離篩選與鑒定[J]. 中國農學通報，2009，25（18）：22-24.

[3]Boone D R，Castenholz R. Volume one：the Archaea and the deeply branching and phototropic bacteria[M]. 2nd ed. New York：Springer-Vedag，2001：243-245.

[4] Bressollier P，Letourneau F，Urdaci M，et al. Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（6）：2570-2576.

[5] Tapia D M T，Contiero J. Production and partial characterization of keratinaseproduced by a microorganism isolated from poultry processing plantwastewater[J]. African Journal of Biotechnology，2008，7（3）：296-300.

[6] Williams C M，Richer C S，MacKenzie J M，et al. Isolation，identification，and characterization of feather-degrading bacterium[J]. Applied and Environmental Microbiology，1990，56（6）：1509-1515.

[7]王爽. 角蛋白降解菌NJQ2和NJQ3混合固態發酵羽毛粉的研究[D]. 南京：南京農業大學，2012：34-36.

[8]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：349-370.

[9]聶康康，姚大偉，郭俊清，等. 一株高效羽毛降解菌株的分離與鑒定[J]. 氨基酸和生物資源，2010，32（1）：18-20.

[10]中華人民共和國商業部. 蛋白酶活力測定法：SB/T 1037—1999[S].北京：中國標準出版社，2004.

[11]晏愛芬，余麗，林連兵. 騰沖熱海嗜熱芽孢桿菌的分離鑒定[J]. 科學技術與工程，2012，12（15）：3564-3567.

[12]Suntornsuk W，Tongjun J，Onnim P，et al. Purification and characterisation of keratinase from a thermotolerant feather-degrading bacterium[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2005，21（6/7）：1111-1117.

[13]Cheng S W，Hu H M，Shen S W，et al. Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis PWD-1[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1995，59（12）：2239-2243.[HJ1.83mm]

[14]Shin J C H. Recent development in poultry waste digestion and feather utilization-a review[J]. Poultry Science，1993，72（9）：1617-1620.

[15]Williams C M，Richter C S，Mackenzie J M，et al. Isolation，identification，and characterization of a feather-degrading bacterium[J]. Applied and Environmental Microbiology，1990，56（6）：1509-1515.

[16]Lin X，Lee C G，Casale E S，et al. Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain[J]. Applied and Environmental Microbiology，1992，58（10）：3271-3275.

[17]Lin X，Kelemen D W，Miller E S，et al. Nucleotide sequence and expression of kerA，the gene encoding a keratinolytic protease of Bacillus licheniformis PWD-1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（4）：1469-1474.

[18]Lin X，Shih J，Swaisgood H E. Hydrolysis of feather keratin by immobilized keratinase[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62（11）：4273-4275.

[19]傅偉. 地衣芽孢桿菌降解羽毛角蛋白及其發酵產角蛋白酶的研究[D]. 杭州：浙江大學，2007：55-57.

[20]Gessesse A，Hatti-Kaul R，Gashe B A，et al. Novel alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather[J]. Enzyme and Microbial Technology，2003，32（5）：519-524.

[21]亓魯，姚大偉，楊德吉. 羽毛粉麩皮混合固態發酵條件優化[J]. 畜牧與獸醫，2014，46（3）：10-14.