改性殼聚糖的性質及對纖維素酶的固定效果

毛加寧+楊瑩+農向

摘要：采用改性殼聚糖作為載體研究改性殼聚糖作為固定化材料對纖維素酶吸附大小的影響。結果表明，當交聯劑濃度達到4%時對改性固定化酶活性影響最大，改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為4.3，改性殼聚糖作為載體的固定化纖維素酶米氏常數為3.7×10-3，未改性殼聚糖為載體的固定化纖維素酶的米氏常數為7.2×10-3，用改性殼聚糖作為載體的固定化纖維素酶最適溫度為55 ℃左右。結果表明，改性殼聚糖作為載體固定化纖維素酶可以提高游離酶的性質。

關鍵詞：纖維素酶；殼聚糖；固定化；改性

中圖分類號： S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0160-04

纖維素作為地球上最豐富的可再生資源，具有廣闊的開發利用前景，以纖維素酶為固化對象，通過試驗比較化學改性與未改性殼聚糖固化酶載體，探索固化酶的制備方法與性質，旨在研究固化酶的最適條件，從而改善傳統意義殼聚糖固定化纖維素酶的相關研究。甲殼類動物廢棄的外殼中可以提取一種多糖——殼聚糖，學名為2-氨基-1，4-β葡聚糖，含有極其豐富的甲殼素（chitin）。殼聚糖的結構與纖維素類似，也是至今為止在自然界中被發現的唯一的陽離子型可食用纖維，對疾病有很好的保健和預防作用[1-4]。由于分子中存在氨基，使其易于酶共價結合，也可絡合金屬離子，化學性質較穩定，耐熱性好，經常作為固定化酶的載體[5-8]。本試驗通過采用化學方法改性殼聚糖固定化纖維素酶，改變殼聚糖的某些分子結構，探索相比未改性殼聚糖分子更優化的性質。

本研究采用簡單的化學方法對殼聚糖進行了改性，并采用拉曼光譜和X光衍射分別測定了改性殼聚糖的部分性質。最后，研究了改性殼聚糖固定化纖維素酶的效果。

1材料與方法

1.1試驗材料

纖維素酶，殼聚糖，氨基硫脲-殼聚糖改性產物，3，5-二硝基水楊酸染色液，羧甲基纖維素鈉鹽溶液，其他試劑均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1纖維素酶液的制備取1 g纖維素酶，加入1 000 mL蒸餾水，充分攪拌直至全部溶解，得纖維素酶液，4 ℃保存備用。

1.2.2羧甲基纖維素鈉鹽溶液的配制準確稱取1.00 g羧甲基纖維素鈉，用50 mmol/L、pH值為 5.0的檸檬酸鈉緩沖液加熱溶解后，轉移到100 mL容量瓶中，待冷卻后，用該緩沖液定容至刻度，4 ℃保存備用。母液A（0.2 mol/L檸檬酸溶液）：稱取42.03 g C6H8O7·H2O 溶解稀釋至1 000 mL；母液B（0.2 mol/L 檸檬酸鈉溶液）：稱取58.82 g Na3C6H5O7·2H2O 溶解稀釋至1 000 mL；取20.5 mL母液A和29.5 mL母液B混合，調節pH值至5.0，稀釋至200 mL，即得 50 mmol/L、pH值為 5.0的檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.3固定化酶活性測定

在一定量固定化酶中（一般取0.1～0.5 g）加入一定量（一般為3.0 mL）羧甲基纖維素鈉鹽溶液，40 ℃水浴保溫10 min后離心5 min，吸取反應液 2.0 mL，加入0.4 mL 2 mol/L NaOH溶液，加入0.8 mL 3，5-二硝基水楊酸顯色劑，定容至6.2 mL，沸水浴中加熱5 min后流水冷卻，在最適條件（40 ℃）下，1 min內催化1 μmol底物轉化為產物所需的酶量定為1個活性單位，用721分光光度計在490 nm處測定吸光度[5]。

1.2.4殼聚糖改性產物的制備

殼聚糖乙酸溶液的制備[1]：將1 g殼聚糖在100 mL蒸餾水中浸泡潤濕15 min，然后加入40 mL 2.5%的乙酸溶液，充分攪拌使其溶解，即得到殼聚糖乙酸溶液。

殼聚糖改性吸附劑的制備：稱取3 g氨基硫脲置于 250 mL 燒杯中，加入100 mL蒸餾水，加熱攪拌至50 ℃時，逐滴加入6 mL 25%的戊二醛溶液，并充分反應45 min。加入配制好的殼聚糖乙酸溶液，加熱至70 ℃，充分反應30 min后，取出反應物，流水冷卻，再分3次加入80 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，攪拌充分后，抽濾，用蒸餾水洗滌產物至濾液pH值為7.0，再用乙酸乙酯、無水乙醇分別洗滌后，放入真空干燥箱于60 ℃下至質量不再變化，最終獲得淡黃色固體粉末狀殼聚糖改性產物。

1.2.5纖維素酶的固定化

稱取2 g改性殼聚糖，加入100 mL 6%的戊二醛，充分攪拌3.5 h直至溶解，靜置24 h，3 000 r/min 離心5 min后棄去上清液，水洗2～3次以除去殘余戊二醛，抽濾，往交聯后的殼聚糖中加入1 g纖維素酶，室溫下繼續攪拌2.5 h，轉入冰箱于4 ℃保存備用。靜置24 h，3 000 r/min 離心5 min后棄去上清液，水洗2～3次，抽濾即得改性固定化酶；稱取一定量的未改性殼聚糖作以上同樣的處理，即得未改性固定化酶。

1.2.6酶活性的測定

葡萄糖含量的測定用3，5 - 二硝基水楊酸法，并作如下修改：1 mg/mL標準葡萄糖水溶液，濃度梯度終體積為4 mL，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸準確煮沸5 min，流水冷卻后于520 nm處比色，利用標準曲線計算產生的葡萄糖量，從而計算酶活性，以葡萄糖質量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。最后做出的標準曲線公式為 y=1.935 40x-0.062 05，r2=0.996 51。

2結果與分析

2.1拉曼光譜（Raman spectra）

拉曼光譜（Raman spectra）是一種散射光譜。拉曼光譜分析法是基于印度科學家C.V.拉曼（Raman）所發現的拉曼散射效應，對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息，并應用于分子結構研究的一種分析方法。

拉曼光譜分析技術是以拉曼效應為基礎建立起來的分子結構表征技術，其信號來源于分子的振動和轉動。拉曼光譜分析技術對不同的物質具有不同的特征光譜，因此可以通過光譜進行改性殼聚糖的定性分析，根據物質對光譜的吸光度的特點，可以對改性殼聚糖物質的量進行分析。

改性殼聚糖或未改性殼聚糖的拉曼光譜都產生了明顯的波長變化，隨著拉曼頻移逐漸增大，殼聚糖的拉曼光強逐漸減小，相比未改性殼聚糖，改性殼聚糖在拉曼頻移為1 300 cm-1時，拉曼光強為32 000左右，而未改性殼聚糖在拉曼頻移為 1 300 cm-1 時，拉曼光強為18 000左右（圖1）。拉曼散射光的強度并不是在所有方向上相等。影響2種殼聚糖拉曼峰強的因素有很多，晶體材料比非晶體材料有更強的拉曼峰，拉曼強度也會隨鍵級而增強。

2.2X光衍射（X-ray diffraction）

X光衍射（X-ray diffraction），即X射線衍射。X光的波長范圍為10-2～102 nm，與原子尺度接近。X光繞射廣泛被用來探知物質內部的微結構，利用特性X光入射到結晶材料，在某些入射角材料的相鄰結晶面散波彼此相位相同，且光程[CM（25]差為波長的整數倍，因此發生了建設性干涉。根據改性殼

[FK（W21][TPMJN1.tif]

聚糖與未改性殼聚糖結晶結構的不同，有所謂的空間群（space group）的區分，即使結構相同晶體內部原子組成不同，其結構因子（structure factor）不同，對于X光散射能力也不同。

X光衍射可以進行多物相成分的定性分析，殼聚糖的2種晶形分別稱為FormI（2θ在32°左右）和FormII（2θ在20°左右），如圖2所示，改性殼聚糖在32°有明顯的衍射峰，表明原料殼聚糖粉末只有FormI一種晶體存在。當殼聚糖被改性后，改變了殼聚糖分子的結構，FormI晶形的衍射峰從20.0°遷移到32.8°，這表明伴隨著殼聚糖改性，一種新的晶體逐步形成。

2.3用不同濃度的戊二醛溶液對2種固定化酶活性的影響

稱取6份0.1 g 改性殼聚糖于小燒杯中，分別加入濃度為1%～6%的戊二醛溶液5.0 mL，充分攪拌3.5 h，置于離心機中3 000 r/min離心10 min進行分離，用蒸餾水洗滌2～3次以除去溶液中的戊二醛，往交聯物中分別加入4.0 mL 1 g/L 的纖維素酶溶液，置于4 ℃冰箱中，1 h攪拌1次，持續24 h，3 000 r/min 離心5 min棄去上清液，水洗3次，得固定化酶。稱取6份0.1 g 未改性殼聚糖作同樣的處理。

固定化酶活性測定結果如圖3所示，殼聚糖改性固化酶最適戊二醛交聯濃度為3%，未改性殼聚糖固化酶最適戊二醛交聯濃度為4%，當戊二醛的濃度達到3%時，改性固化酶的活力已達到最大。

[BT2+*5]2.42種固定化酶的最適pH值

準確配制pH值為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6的 HAc/NaAc 緩沖液。吸取梯度緩沖液各1.5 mL，分別加入 15 mL 20 %的蔗糖溶液。與改性固定化酶反應時，先在固定化酶中加入1 mL蒸餾水，混勻后再將蔗糖溶液倒入纖維素酶中，30 ℃反應 5 min，殼聚糖固定化酶則用沸水浴反應 1 min 終止反應，4 000 r/min離心5 min，各管取反應液 0.5 mL，加入35 mL蒸餾水中，加入1 mL染色液，顯色后測吸光度。結果如圖4所示，改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為4.3，而未改

性殼聚糖固定化酶的最適pH值為3.8。

2.5原酶、固定化酶與改性固定化酶米氏常數的比較

平行取固定化酶與改性固定化酶各0.1 g、原酶0.5 mL（1 g/L）各6份，分別與一定量（3.0 mL）不同濃度（1%～6%）的底物于40 ℃水浴中反應15 min，測其吸光度，用Linew eaver Burk雙倒數法作圖，求得米氏常數（Km）。結果如圖5所示，原酶的Km值為7.3×10-3 g/L，未改性固化酶的Km值為 72×10-3 g/L，改性固化酶的Km值為3.7×10-3 g/L，殼聚糖被改性后，固定纖維素酶表現為米氏常數減小。

2.6溫度對酶活性的影響

酶在固定化后，穩定性普遍增加，這主要表現在改性固定化酶的最適溫度較原酶高，對熱的穩定性也較原酶高。

平行取0.1 g固定化酶、0.1 g改性固定化酶和0.5 mL 1 g/L 的原酶各6份，分別在不同溫度（30～80 ℃）條件下測定酶活性。如圖6所示，未改性固化酶的最適溫度為40 ℃，之后隨著溫度升高，曲線趨勢較陡峭，酶的活性降低；當殼聚糖被改性后，使得酶的最適溫度有所提升，改性固化酶活性的最適溫度在55 ℃左右，相比未改性固化酶，改性固化酶對熱的穩定性有所提高。

2.7改性殼聚糖、未改性殼聚糖固定化酶的穩定性

隨著時間的推移，殼聚糖固化酶的穩定性由高變低，在 12～24 h固化酶的穩定性普遍較好，相比未改性固化酶，改性殼聚糖固化酶有更好的穩定性（圖7）。

3討論

大多數試驗中均采用殼聚糖作吸附劑、戊二醛為交聯劑固定化酶[2]，但采用化學方法改性殼聚糖固定化纖維素酶，卻沒有相關說明。通過試驗改性殼聚糖，殼聚糖作為載體的性能得到了提高。

試驗中發現當交聯劑濃度為4%時，對改性固定化酶活性影響最大；改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為4.3，未改性殼聚糖固定化酶的最適pH值為3.8；采用改性殼聚糖為載體的纖維素固化酶的米氏常數為3.7×10-3 g/L，未改性殼聚糖為載體的纖維素固化酶的米氏常數為7.2×10-3 g/L，將纖維素酶用改性殼聚糖固定后，改性固化酶最適溫度在55 ℃左右，未

改性固化酶最適溫度為40 ℃，通過試驗對比改性固定化酶與未改性固定化酶發現，改性固定化酶熱穩定性與貯藏穩定性更高。

殼聚糖與甲殼素作為自然界唯一的堿性多糖，來源廣泛，更簡單制備，對于其利用開發，對環境保護和資源開發有著一定的作用[9-13]。通過研究發現，將殼聚糖通過化學方法改性處理后，殼聚糖的分子結構產生了變化，性質也跟改性前大不相同，在戊二醛濃度對固定化酶活性影響的試驗中，改性殼聚糖固定化酶的最適pH值高于未改性殼聚糖，固定化酶的活性也比未改性殼聚糖固定化酶的略高，在對溫度的研究中，改性固定化酶比未改性固化酶的耐受溫度更高，穩定性也更強。酶的活性容易受環境條件的影響，通過固定化，正好可以將纖維素酶的活性得以保留。

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