響應(yīng)面法對(duì)光合細(xì)菌還原亞碲酸鹽條件的優(yōu)化

易馨+楊開(kāi)智+童晉+李明學(xué)+謝鴻觀

摘要：以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的1株對(duì)亞碲酸鹽有還原能力的光合細(xì)菌——沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面法對(duì)其還原亞碲酸鹽的條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以碲的還原率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken（BB）設(shè)計(jì)，利用Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行4因素3水平下的多元二次回歸擬合分析，確定最佳還原條件為：菌種接種量8%（體積分?jǐn)?shù)，下同），初始碲濃度63 mg/L，初始pH值6.2，接種后培養(yǎng)9 d，則亞碲酸鹽的還原率可達(dá)99.76%。反應(yīng)過(guò)程中還原條件的優(yōu)化，對(duì)后期利用微生物治理環(huán)境的碲污染具有參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：光合細(xì)菌；亞碲酸鹽；最佳還原條件；響應(yīng)面法；碲污染治理

中圖分類號(hào)： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0217-04

碲（Te）是一種非金屬稀散元素，于1782年在金礦中發(fā)現(xiàn)[1]。碲及其化合物廣泛應(yīng)用于冶金、化工、電子、醫(yī)藥等行業(yè)，被譽(yù)為“現(xiàn)代工業(yè)、國(guó)防與尖端技術(shù)的維生素”“當(dāng)代高技術(shù)新材料的支撐材料”[2]。隨著碲的廣泛應(yīng)用，對(duì)環(huán)境造成的污染也日益增加。

碲的化合物在很低的濃度水平都具有毒性，其中以亞碲酸鹽（TeO32-）的毒性最強(qiáng)，是污染環(huán)境的主要物質(zhì)之一。亞碲酸鹽具有很好的水溶性且易于進(jìn)入生物體內(nèi)，其毒性遠(yuǎn)比單質(zhì)碲的毒性強(qiáng)，主要是其具有氧化性[3]，而單質(zhì)碲不溶于水，常被認(rèn)為無(wú)生物利用性。將污染物中易溶有毒的亞碲酸鹽還原成碲單質(zhì)，從而可以達(dá)到去除這種元素的目的。微生物的這種作用在環(huán)境碲污染的治理方面具有應(yīng)用前景。

響應(yīng)面分析法（response surface analysis methodology，RSM）是目前廣泛應(yīng)用的一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，通過(guò)多元二次回歸方程擬合多因子與響應(yīng)值間的關(guān)系進(jìn)行模型預(yù)測(cè)，并可得到最佳優(yōu)化條件[4]。成都理工大學(xué)測(cè)試樓微生物實(shí)驗(yàn)室前期獲得1株對(duì)亞碲酸鹽有還原能力的光合細(xì)菌——沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris），本研究對(duì)其還原亞碲酸鹽的影響條件進(jìn)行系統(tǒng)研究，用響應(yīng)面法分析確定了最佳還原條件，對(duì)后期利用微生物治理環(huán)境中的碲污染問(wèn)題具有指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1菌種

試驗(yàn)菌種為實(shí)驗(yàn)室前期儲(chǔ)藏的1株對(duì)亞碲酸鹽有還原能力的沼澤紅假單胞菌。

1.2供試培養(yǎng)基

培養(yǎng)基采用RCVBN液體培養(yǎng)基，其配方如下：DL-蘋(píng)果酸4.00 g，（NH4）2SO4 1.00 g，KH2PO4 1.36 g，K2HPO4·3H2O 1.24 g，MgSO4·7H2O 120 mg，CaCl2·2H2O 75 mg，EDTA 20 mg，維生素B1 1 mg，煙酸 1 mg，生物素 15 μg，微量元素 1 mL，雙蒸水 1 L。微量元素包括H3BO3 2.8 mg、ZnSO4·7H2O 240 μg、MnSO4·H2O 1.6 mg、Cu（NO3）2·3H2O 40 μg、Na2MoO4·2H2O 750 μg，雙蒸水 1 L。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1單因素試驗(yàn)優(yōu)化亞碲酸鹽還原條件

1.3.1.1菌種接種量的考察將初始碲濃度為60 mg/L的100 mL液體培養(yǎng)基用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7.0，分別按體積分?jǐn)?shù)為1%、3%、5%、7%、9%、11%的接種量將在30 ℃下培養(yǎng)了5 d的沼澤紅假單胞菌接種至培養(yǎng)基中，置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中。

1.3.1.2初始碲濃度的考察將接種了5%沼澤紅假單胞菌的液體培養(yǎng)液置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d后將不同濃度的亞碲酸鈉溶液加入培養(yǎng)基中，使其初始碲濃度分別為20、40、60、80、100、120、140 mg/L，初始pH值均為7.0。

1.3.1.3初始pH值的考察將初始碲濃度為60 mg/L的100 mL液體培養(yǎng)基用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值分別為5.0、55、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并將在30 ℃培養(yǎng)了5 d的沼澤紅假單胞菌按5%接入培養(yǎng)基中混合，置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中。

以上幾組培養(yǎng)基均培養(yǎng)8 d后，用滅菌的針筒分別抽取上述菌液10 mL于潔凈離心管中，置于高速離心機(jī)中離心分離（5 000 r/min，t=10 min），取上清液用一次性的0.22 μm濾膜過(guò)濾，并測(cè)定濾液中剩余碲的濃度。

1.3.1.4接種后培養(yǎng)時(shí)間的考察將初始碲濃度為 60 mg/L 的500 mL液體培養(yǎng)基用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7.0，并將在30 ℃培養(yǎng)了5 d的沼澤紅假單胞菌菌株按5%接入培養(yǎng)基中混合，置于30 ℃光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 d時(shí)，分別用滅菌的針筒分別抽取菌液 10 mL 于潔凈離心管中，置于高速離心機(jī)中高速離心分離（5 000 r/min，t=10 min），取上清液用一次性的0.22 μm濾膜過(guò)濾，并測(cè)定濾液中剩余碲的濃度。

1.3.2響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)沼澤紅假單胞菌的接種量、初始碲濃度、初始pH值及接種后培養(yǎng)時(shí)間（分別記為A、B、C、D），每個(gè)因素取3個(gè)水平；以Te4+的還原率作為響應(yīng)值，記為R，進(jìn)行Box-Behnken（BB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立數(shù)學(xué)模型，通過(guò)Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)最優(yōu)還原條件，并按照預(yù)測(cè)最優(yōu)還原條件重復(fù)試驗(yàn)，與模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，驗(yàn)證其有效性。

1.3.3碲還原率的測(cè)定

采用氫化物-原子熒光儀（HG-AFS）測(cè)定培養(yǎng)液中Te4+的濃度[5]。

[JZ]碲還原率=（A-B）/A×100%。

式中：A為初始碲濃度，mg/L；B為還原后培養(yǎng)基中Te4+濃度，mg/L。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌還原亞碲酸鹽現(xiàn)象

沼澤紅假單胞菌在未添加亞碲酸鈉的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d，結(jié)果如圖1（右）所示，培養(yǎng)液由無(wú)色逐漸變成紅色，這是細(xì)菌正常培養(yǎng)的顏色。而沼澤紅假單胞菌在含亞碲酸鈉的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d，結(jié)果見(jiàn)圖1（左），培養(yǎng)液顏色逐漸變?yōu)楹谏@是由于沼澤紅假單胞菌將Na2TeO3還原成黑色單質(zhì)碲的緣故。

2.2菌種接種量對(duì)亞碲酸鹽還原率的影響

在不同的菌種接種量條件下，沼澤紅假單胞菌對(duì)亞碲酸鹽的還原率存在明顯的差異，結(jié)果如圖2所示。隨著菌種接種量的增加，沼澤紅假單胞菌對(duì)碲的還原率明顯提高；當(dāng)接種量達(dá)到5%時(shí)，還原率達(dá)到一個(gè)高值，為90.24%；隨后再增加菌種接種量，碲的還原率變化不大，由此推測(cè)，當(dāng)菌種接種量低于5%時(shí)，菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢，嚴(yán)重影響了碲的還原率，當(dāng)菌種接種量≥5%時(shí)，對(duì)亞碲酸鹽還原效果更好。

2.3初始碲濃度對(duì)亞碲酸鹽還原率的影響

沼澤紅假單胞菌在不同的初始碲濃度條件下培養(yǎng)，對(duì)碲的還原率如圖3所示。隨著初始碲濃度的增大，對(duì)碲的還原率呈現(xiàn)上升—下降的趨勢(shì)。碲的還原效果在亞碲酸鈉添加量低于 60 mg/L 時(shí)，碲還原率呈緩慢上升趨勢(shì)，達(dá)到最大值（9098%），說(shuō)明菌株可忍受一定濃度的亞碲酸鹽，而未受到TeO32-的抑制且菌株活性良好。當(dāng)初始碲濃度超過(guò)60 mg/L

時(shí)，隨著碲濃度的升高，其較高的毒性抑制了菌的活性，碲還原率逐漸降低。

2.4pH值對(duì)亞碲酸鹽還原率的影響

在不同的pH值條件下，菌株還原碲的效果如圖4所示。當(dāng)pH值為6.5～7.5時(shí)，碲還原效果較好，還原率為 90.09%～91.13%，因此試驗(yàn)中采用的沼澤紅假單胞菌適宜的生長(zhǎng)代謝pH值范圍為6.5～7.5[6]。當(dāng)pH值<6或pH值>8時(shí)，碲還原率相對(duì)較低。可見(jiàn)，過(guò)高或過(guò)低的pH值環(huán)境會(huì)直接影響菌的酶活性，抑制其生長(zhǎng)和代謝能力，不利于菌株對(duì)亞碲酸鈉的還原。

2.5接菌種后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)亞碲酸鹽還原率的影響

沼澤紅假單胞菌接種后隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化，碲的還原率也存在明顯的變化，結(jié)果如圖5所示。接種培養(yǎng)的前7 d，隨著菌的生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的TeO32-濃度降低，碲還原率迅速增長(zhǎng)。在培養(yǎng)后8 d，對(duì)亞碲酸鹽的還原率達(dá)到一個(gè)高值，為89.09%；隨后，隨著時(shí)間的推移，碲還原率達(dá)到穩(wěn)定期。這一[JP3]趨勢(shì)與細(xì)菌在亞碲酸鹽的脅迫下菌體的生長(zhǎng)曲線相符合，說(shuō)明沼澤紅假單胞菌還原亞碲酸鹽可能依賴菌體生物量的生長(zhǎng)。

2.6Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化還原條件

2.6.1模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

將菌種接種量、初始碲濃

2.6.3最佳還原條件的預(yù)測(cè)與檢驗(yàn)

根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出沼澤紅假單胞菌還原亞碲酸鹽的條件為：菌種接種量8%，初始碲濃度63.29 mg/L，初始pH值 6.23，接種后培養(yǎng)9 d，在此條件下，亞碲酸鹽的還原率在理論上可達(dá)107.38%。考慮到實(shí)際可操作性，將還原條件修正為：菌接種量8%，初始碲濃度63 mg/L，初始pH值 6.2，接種培養(yǎng)9 d。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在最優(yōu)的還原條件下進(jìn)行試驗(yàn)，6組平行試驗(yàn)的平均值為99.76%，試驗(yàn)結(jié)果與模型復(fù)合良好。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的沼澤紅假單胞菌還原亞碲酸鹽的條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有利用價(jià)值。

3結(jié)論與討論

利用微生物將溶解性強(qiáng)的亞碲酸鹽還原成溶解性差、無(wú)毒的碲單質(zhì)的報(bào)道有很多[7-10]，如Lloyd等利用大腸桿菌（Escherichia coli）對(duì)亞碲酸鹽還原，發(fā)現(xiàn)碲單質(zhì)積累在靠近細(xì)胞膜位置[7]；Klonowska等發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）能夠在厭氧條件下還原亞碲酸鹽[9]。目前，對(duì)細(xì)菌還原亞碲酸鹽影響條件的系統(tǒng)研究還較少。通過(guò)單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化光合細(xì)菌還原亞碲酸鹽影響條件，得到優(yōu)化還原條件為：菌接種量8%，初始碲濃度63 mg/L，初始pH值 6.2，接種后培養(yǎng)9 d，在此條件下，亞碲酸鹽的還原率可達(dá)99.76%。在此試驗(yàn)范圍內(nèi)建立起的二次線性回歸模型準(zhǔn)確有效，對(duì)試驗(yàn)擬合較好。說(shuō)明本研究對(duì)后期利用微生物治理環(huán)境中的碲污染問(wèn)題具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fan Y Q，Yang Y X，Xiao Y P，et al. Recovery of tellurium from high tellurium-bearing materials by alkaline pressure leaching process：thermodynamic evaluation and experimental study[J]. Hydrometallurgy，2013，139：95-99.

[2]方錦，王少龍，付世繼.從碲渣中回收碲的工藝研究[J]. 材料研究與應(yīng)用，2009，3（3）：204-206.

[3]Kim D H，Kanaly R A，Hur H G. Biological accumulation of tellurium nanorod structures via reduction of tellurite by Shewanella oneidensis MR-1[J]. Bioresource Technology，2012，125：127-131.

[4]梁紅昌，張慶華，吳瑜瑜，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化曲霉Asaw117脫色培養(yǎng)基的研究[J]. 環(huán)境工程，2009（1）：218-221.

[5]郭小偉，郭旭明. 從堿性溶液中發(fā)生氫化物的原子熒光/原子吸收光譜法測(cè)定Te4+及Te6+[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，1996，16（3）：88-92.

[6]陳燕紅，楊紫紅，喻國(guó)輝，等. 光照、氧氣、pH和鹽度對(duì)沼澤紅假單胞菌2-8菌株生長(zhǎng)和亞硝酸鹽消除的影響[J]. 南方水產(chǎn)，2010，6（4）：1-5.

[7]Lloyd-Jones G，Osborn A，Ritchie D，et al. Accumulation and intracellular fate of tellurite in tellurite-resistant Escherichia coli：a model for the mechanism of resistance[J]. FEMS Microbiology Letters，1994，118（1/2）：113-119.

[8]Diaz-Vasquez W A，Abarca-Lagunas M J，Arenas F A，et al. Tellurite reduction by Escherichia coli NDH-Ⅱ dehydrogenase results in superoxide production in membranes of toxicant-exposed cells[J]. BioMetals，2014，27（2）：237-246.

[9]Klonowska A，Heulin T，Vermeglio A. Selenite and tellurite reduction by Shewanella oneidensis[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（9）：5607-5609.

[10]Wang X J L G，Zhou J T E A. Quinone-mediated reduction of selenite and tellurite by Escherichia coli[J]. Bioresource Technology，2011，102（3）：3268-3271.