1株華木蓮內生真菌的抗氧化活性分析和菌株鑒定

劉紫英 袁斌 冷桂華

摘要：華木蓮（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng）為木蘭科中我國特有的單種屬植物，全世界唯宜春特有的珍稀瀕危新樹種，對從華木蓮葉片中分離的多株內生真菌進行抗氧化活性分析，篩選出抗氧化性較高的菌株并鑒定。篩選華木蓮葉片的內生真菌，制備其發酵液提取物，采用TBA反應法、超氧陰離子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）、羥基自由基（·OH）清除能力的分析測定其抗氧化活性，對抗氧化活性高的內生真菌菌株利用試劑盒提取內生真菌總DNA，擴增其rDNA的ITS序列并測序。結果顯示，菌株SL-3的總抗氧化活性很高，比對照、以維生素C為底物的高。通過對抗氧化活性成分的分析可知，該菌株含有黃酮類化合物。對菌株SL-3進行形態和分子鑒定，確定為產黃青霉（Penicillium chrysogenum）。說明內生真菌SL-3產黃青霉具有明顯和穩定的抗氧化活性，可用于抗氧化活性成分發酵生產的微生物資源。

關鍵詞：華木蓮；內生真菌；抗氧化活性；ITS序列；黃酮類化合物；菌株鑒定；產黃青霉；微生物資源

中圖分類號： S567.23+9.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0213-04

華木蓮（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng）別稱落葉木蓮，為我國特有單種屬植物，屬于木蘭科，已被列為國家Ⅰ級重點保護植物，全球僅狹域分布于江西省宜春市，是特有的珍稀樹種。目前，國內外僅施建敏等對華木蓮葉黃酮類化合物和多糖的抗氧化作用進行了研究，結果顯示，華木蓮葉內黃酮類化合物和多糖的抗氧化性效果很好[1-2]，華木蓮具有潛在的利用價值，可成為抗衰老保健品輔料或功能因子[3]。現有研究結果表明，植物內生真菌可能產生與其宿主體內相同或相似的生理活性成分，植物內生菌是分離新的天然活性成分和開發新藥的潛在資源，成為當今的研究熱點[4-5]。筆者前期已研究過華木蓮葉中內生真菌的群落結構[6]，分離并鑒定74株華木蓮葉內生真菌。現以華木蓮的內生真菌為研究對象，通過對多株內生真菌進行發酵振蕩培養，利用硫巴比妥酸（TBA）反應法、超氧陰離子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）、羥基自由基（·OH）清除能力研究其培養液提取物具有抗氧化活性，篩選出抗氧化活性成分的內生真菌并鑒定其種屬。

1材料與方法

1.1試驗材料

華木蓮取材于江西省宜春市明月山風景區周邊林木種植場所，分別取新鮮健康植株的葉片，組織分離法分離內生真菌，菌株存于宜春學院江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室微生物藥物實驗室，分別編號為SL-1、SL-2、SL-3、SL-22、SL-56、SL-68。

1.2培養基

察氏培養基培養液成分包括NaNO3 2.0 g、K2HPO4 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4 0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30 g，水 1 000 mL，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.3儀器與設備

高速離心機（TGL-16G型）、紫外可見分光光度計 SFZ-UV-2000型（龍尼柯儀器有限公司）、數顯恒溫水浴鍋HH-6（國華電器有限公司）、EHG-B恒溫搖床培養箱（江蘇億通電子有限公司）、PHSJ-4A精密酸度計（上海雷磁分析儀器廠）、RE-2000A旋轉蒸發器（上海嘉鵬科技有限公司）、大龍移液器手動單道可調移液槍100～1 000 μL（芬蘭Dragonmed公司）、SHZ-III/SHZ-IIID循環水真空泵（上海京工實業有限公司）。

1.4樣品與試劑

蕓香苷標準品（10270-200901，中國藥品生物制品檢定所）、硫巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸、正丁醇、抗壞血酸、葡萄糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、七水硫酸鎂、硫酸鐵、精制花生油、鄰苯三酚、水楊酸鈉、過氧化氫、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醚等，以上試劑均為分析純。

1.5試驗方法

1.5.1菌株活化并擴大培養從實驗室保存的菌種中挑取少量接種于察氏培養基上培養6 d，用打孔器在平板上取長勢較好的培養菌絲并接種，用于擴大培養。在 250 mL 三角瓶中裝100 mL察氏液體培養基，用12層紗布包好都放入滅菌鍋中滅菌20 min，于28 ℃、160 r/min下振蕩培養7 d。

1.5.2發酵液提取物的制備將培養液進行抽濾除去菌絲和菌絲球，利用旋轉蒸發器進行減壓蒸發濃縮，將100 mL的培養液濃縮至3～4 mL，加入足量無水乙醇振蕩，提取，于 5 000 r/min 下離心15 min，棄沉淀，留上清液。將上述提取液用無水乙醇定容至25 mL。

1.5.3TBA反應法測定培養液提取物抗氧化活性[7]采用的TBA反應法略有改動，配制2.5%精制花生油乙醇溶液作為底物，在各個比色管中分別加入0.02%蕓香苷、抗壞血酸和菌株培養液提取物（以上均采取底物4 mL、反應6 mL進行反應），混勻后于37 ℃水浴中存放；每24 h取出1 mL待測液樣品，加入1 mL 25%三氯乙酸，混勻，放置5 min，然后加入 1 mL 0.67% TBA，于沸水中加熱20 min；取出，冷卻，再加入 4 mL 正丁醇，劇烈振蕩，于4 000 r/min下離心10 min，取上層正丁醇液，于532 nm波長處比色；以蒸餾水代替抗氧化劑的空白樣品作為對照，存放24、48、72、96、120、144 h后測D532 nm值。

1.5.4超氧陰離子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）清除能力的測定[8]

采用鄰苯三酚自氧化進行測定，取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值8.2），4.2 mL蒸餾水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃水浴中預熱過的 3 mmol/L 鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻，倒入比色杯，325 nm下每隔30 s測定吸光度，計算線性范圍內1 min內吸光度的增加量，以 10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。按照上述方法步驟加入鄰苯三酚前先分別加入0.1 mL不同的樣品液，同樣10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照，同樣方法測定吸光度。前后2次的樣品吸光度差（ΔD）與測定時間差（ΔT）的比值即為該時段的鄰苯三酚自氧化速率。

[JZ]清除能力率=（ΔD1/ΔT-ΔD2/ΔT）/ΔD1/ΔT×100%。

式中：ΔD1/ΔT代表鄰苯三酚自氧化時反應速率；ΔD2/ΔT代表加入樣品液后鄰苯三酚自氧化反應速率。

1.5.5樣品對羥基自由基（·OH）的清除率[9]

采用水楊酸比色法進行測定，在4 mL反應液（含0.15 mol/L硫酸亞鐵1 mL、6 mmol/L水楊酸鈉1 mL）中加入不同濃度的樣品 1 mL，再加入雙氧水啟動反應；37 ℃水浴中反應1 h，測定 510 nm 處的吸光度，吸光度越大，則清除羥基自由基效果越好。

[JZ]·OH清除率=[D0-（Di-D0i）]/D0×100%。

式中：D0代表用蒸餾水代替樣品的的對照值；Di代表加樣品后的吸光度；D0i代表樣品本底吸光度。

1.5.6蕓香苷標準曲線的繪制和發酵液中黃酮類化合物濃度的測定[10]

1.5.6.1標準曲線的繪制稱取0.001 5 g蕓香苷標樣，溶于15 mL的30%乙醇溶液中，分別取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 此溶液于10 mL比色管中，各補加30%乙醇溶液使成5 mL體積。加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加100 mg/L硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，再加蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，靜置 15～20 min后，于510 nm處測定吸光度D。

1.5.6.2樣品濃度的測定分別取6個不同編號的10 mL比色管，裝入樣品各5 mL，依次加入50 mg/L亞硝酸鈉 0.3 mL，靜置6 min；加100 mg/L硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，靜置15～20 min，同時以30%乙醇溶液代替樣品液配制空白試劑，在510 nm處測定吸光度D。

1.5.7抗氧化活性高的內生真菌菌株的分子鑒定

用生工生物工程上海（股份）有限公司的真菌基因組DNA提取試劑盒和PCR試劑盒進行擴增、ITS（internal transcribed spacer）序列分析，即根據已知真菌的保守序列設計1對特異性引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR擴增采用20 μL反應體系，反應條件：94 ℃ 1 min；55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 個循環；72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化目的片段，純化產物由生工生物工程上海（股份）有限公司測序。以NCBI數據庫中Blastn程序比對分析，使利用MEGA 6.0軟件和鄰接法（neighbour-joining methods）進行聚類分析鑒定種屬。

2結果與分析

2.1TBA反應法測華木蓮內生真菌抗氧化活性

以2.5%精制花生油乙醇溶液作為底物進行反應，其結果見表1。清除率=（對照的D532 nm-樣品的D532 nm）/對照的D532 nm×100%。由表1可知，D532 nm值越小，抗氧化活性越高。隨時間的延長，該6株內生真菌的發酵液提取物與各抗氧化劑均不同程度抑制了花生油的脂質過氧化。培養144 h時停止該試驗，數據顯示抑制作用還很明顯，其樣品清除率從大到小依次為SL-3>SL-68>SL-22>維生素C>SL-1=蕓香苷>SL-2>SL-56，由此可見菌株SL-3、SL-68、SL-22可以較顯著地延緩花生油的脂質過氧化過程，具有相對較強的抗氧化能力，值得進一步研究。

2.3華木蓮內生真菌發酵液對羥基自由基的清除率

從表3可知，華木蓮內生真菌發酵液對羥基自由基的清除率從大到小依次為SL-3>SL-68>SL-22>SL-2>SL-56>SL-1，相對于超氧陰離子自由基的清除率普遍較高。內生真菌SL-3、SL-68、SL-22對羥基自由基的清除率都比較高，其中SL-3的清除率為64.03%，遠遠高于其他菌株，顯示出很高的抗氧化性。

2.4內生真菌培養液的抗氧化物質中黃酮類化合物濃度

由不同濃度蕓香苷繪制得到標準曲線（圖1），根據該曲線得到標準方程：y=0.018 9x-0.046 2，r2=0.963 3。式中，x代表蕓香苷濃度；y代表吸光度。

同樣有6種樣品在510 nm處的吸光度以及代入式中得到[CM（25]的抗氧化物質的濃度見表4。從表4可以看出，SL-3、

綜上可知，內生真菌SL-3的TBA可以較顯著地延緩脂質過氧化過程，具有相對較強的抗氧化能力，對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率效果很好；SL-3含黃酮類抗氧化物質濃度較高，為34.338 μg/mL，是抗氧化性物質高產菌株，因而對其進行種屬鑒定。

2.5華木蓮內生真菌SL-3種屬鑒定

華木蓮內生真菌SL-3形態學鑒定的方法參見筆者前期的華木蓮葉中內生真菌的群落結構研究[6]，其形態學特點為

典型的青霉屬真菌，現對其進行分子鑒定，經擴增5.8S rDNA序列，并測序內生真菌SL-3的ITS區含548 bp，通過GenBank中進行Blast比對，應用MEGA 6.0軟件中鄰接法（neighbour-joining methods，NJ）構建聚類分析樹狀圖，bootstrap檢驗值≥50%，1 000次重復。基于10個菌株ITS序列采用鄰接法構建系統發育樹，以確證SL-3菌株的分類歸屬（圖2），由此可以看出與內生真菌SL-3處于同一分支的4株菌株均為產黃青霉（Penicillium chrysogenum），并且這個菌株與產黃青霉的ITS序列相似性達99%。Renske等認為， 通過ITS區域比對，序列相似性≥99%，鑒別為相同種，即內生真菌 SL-3 鑒定為產黃青霉[11]。

3結論

目前，尋找外源性自由基清除劑和抗氧化劑來延緩衰老，已經成了國內外研究熱點，木蘭科植物黃酮類化合物含量的測定已有不少研究，但是抗氧化性能方面的研究很少。因此，本試驗采用華木蓮的內生真菌作為對象研究其抗氧化性，結果顯示華木蓮葉內生真菌SL-3是可以產生較多抗氧化物質的菌株，符合相關文獻描述的植物內生真菌可以產生與植物本身相似或相同的抗氧化性物質[5]，而且提取物中的抗氧化物質還是比較多的，對于超氧陰離子自由基、羥基自由基有較強的抑制作用，它們的多種抗氧化活性預示著其產生相關抗氧化化合物的能力；有望成為較好的天然抗氧化性物質，為進一步對其發酵工藝研究成為抗衰老保健品的輔料或功能因子奠定理論基礎。

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