黑木耳栽培過(guò)程中抗霉能力及胞外酶活性變化

李紅+楊鎮(zhèn)+呂立濤+劉巖巖+張敏

摘要：以5個(gè)黑木耳（Auricularia auricula）栽培菌株（8808、黑29、981、黑威2號(hào)、黑威4號(hào)）為試驗(yàn)材料，研究黑木耳栽培過(guò)程中4種胞外酶活性[羧甲基纖維素酶（CMCase）、濾紙纖維素酶（FPase）、漆酶（LAC）、多酚氧化酶（POD）]的變化及酶活性與產(chǎn)量、抗霉能力之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，菌株產(chǎn)量大小排序?yàn)楹谕?號(hào)>黑威4號(hào)>981>8808>黑29，黑威2號(hào)顯著高于其他菌株，黑威4號(hào)和981菌株差異不顯著，8808和黑29菌株產(chǎn)量最低；各菌株抗霉能力有明顯差別，黑威2號(hào)、黑威4號(hào)、981菌株抗霉能力較差，8808和黑29菌株抗霉能力較強(qiáng)。不同菌株胞外酶活性不同，但在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中變化規(guī)律基本一致，即隨著黑木耳子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育，CMCase、FPase、LAC、POD活性逐漸增強(qiáng)，而后維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。8808、黑29菌株CMCase、FPase、POD酶活性相對(duì)較低，981、黑威2號(hào)、黑威4號(hào)菌株酶活性較高。相關(guān)性分析表明，不同胞外酶活性之間具有顯著或極顯著相關(guān)性，不同的胞外酶活性又與抗霉能力、產(chǎn)量有一定的相關(guān)性，從而為黑木耳抗病育種、黑木耳生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黑木耳栽培；抗霉能力；胞外酶；酶活性；產(chǎn)量；抗霉能力

中圖分類(lèi)號(hào)： S646.601文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0109-04

黑木耳（Auricularia auricula）是中國(guó)廣泛人工栽培的食用菌品種，其栽培業(yè)已成為廣大菇農(nóng)走上致富道路的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。黑木耳食味鮮美，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的食、藥用價(jià)值[2-3]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，對(duì)木耳的消費(fèi)需求激增，木耳總產(chǎn)量也隨之快速增長(zhǎng)。但大量菌種品種退化、老化、不利變異，致使栽培性狀難以預(yù)測(cè)，造成栽培特性、栽培產(chǎn)量的不確定性[1]。有研究報(bào)道，側(cè)耳（Pleurotus）、金針菇（Flammulina velutipes）菌絲羧甲基纖維素酶活性與子實(shí)體產(chǎn)量成正相關(guān)關(guān)系，以木屑為主料栽培的黑木耳在子實(shí)體形成期間胞外纖維素酶活性逐漸上升[4]。黑木耳的纖維素酶、半纖維素酶活性與栽培基質(zhì)的降解速率、子實(shí)體的產(chǎn)量有關(guān)，表明食用菌胞外酶活性變化在栽培過(guò)程中存在一定的規(guī)律[5-7]。從目前的研究成果來(lái)看，相關(guān)食用菌胞外酶活性研究報(bào)道較多，而如何通過(guò)菌種檢測(cè)，鑒定菌種活性、健康程度，預(yù)測(cè)栽培特性、栽培產(chǎn)量的研究較少[5-7]。黑木耳菌種培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)酶活性測(cè)定研究菌種生長(zhǎng)中的酶活性變化規(guī)律，檢測(cè)菌種分解纖維素、木質(zhì)素等的能力，可在一定程度上檢測(cè)菌種老化、退化、不利變異，杜絕劣質(zhì)菌種危害菇農(nóng)，為黑木耳栽培生產(chǎn)提供科學(xué)、系統(tǒng)的理論依據(jù)，因此研究黑木耳胞外酶在栽培過(guò)程中的活性變化規(guī)律對(duì)菌種優(yōu)劣顯得十分重要[5-6，8]。一方面通過(guò)各菌株培養(yǎng)時(shí)間與酶活性變化關(guān)系的研究，探討菌株菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中酶活變化的規(guī)律性；另一方面通過(guò)纖維素、木質(zhì)素分解酶類(lèi)的測(cè)定，可檢測(cè)菌株分解基質(zhì)能力強(qiáng)弱變化，檢測(cè)菌株因在非纖維基質(zhì)中長(zhǎng)期生長(zhǎng)、保藏、傳代引起酶活性退化問(wèn)題，檢測(cè)因大量引種、擴(kuò)繁引起的菌株老化、退化、不利變異的發(fā)生以及病毒感染引起菌株退化問(wèn)題，防止劣質(zhì)菌種流入市場(chǎng)[2-3]。有鑒于此，本試驗(yàn)選擇栽培性狀差異較大的5個(gè)黑木耳優(yōu)良菌株，研究栽培過(guò)程中菌株胞外漆酶（LAC）、多酚氧化酶（POD）、羧甲基纖維素酶（CMCase）、濾紙纖維素酶（FPase）的酶活性變化，為我國(guó)黑木耳栽培用種活力檢測(cè)、菌種退化及黑木耳栽培工作提供科學(xué)系統(tǒng)的理論參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

黑木耳1～5號(hào)菌株分別為8808、黑29、981、黑威2號(hào)、黑威4號(hào)，均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.2培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基（L）：馬鈴薯200.0 g煮汁，葡萄糖20.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，蛋白胨0.5 g，維生素B1 10.0 mg，瓊脂粉14.0 g。

1.3試驗(yàn)方法

原種瓶（500 mL葡萄糖空瓶）裝培養(yǎng)料折合干料約140 g（濕質(zhì)量400 g），栽培袋裝培養(yǎng)料折合干料約280 g（濕質(zhì)量800 g），121 ℃滅菌2 h，取母種培養(yǎng)基活化菌種3塊（3.0 mm×3.0 mm）接于原種培養(yǎng)料中，25 ℃培養(yǎng)30 d，菌絲發(fā)滿后以2%的接種量接入栽培種培養(yǎng)料中，25 ℃培養(yǎng)70 d，每個(gè)菌株各接種100袋。分別在菌絲生長(zhǎng)10、20、30、40、50、60、70 d 時(shí)取樣，每個(gè)菌株每個(gè)時(shí)期取樣3袋，分別壓碎混勻，用于粗酶液制備。

1.5粗酶液制備

250 mL三角瓶中裝入打碎混勻樣品5.0 g，加蒸餾水 25 mL，25 ℃下150 r/min浸提4 h，4 ℃離心10 min（2 500 r/min），上清為粗酶液，4 ℃冰箱短期保存，酶活性測(cè)定設(shè)1個(gè)空白對(duì)照、3個(gè)重復(fù)。

均勻取培養(yǎng)一定時(shí)間的酶樣培養(yǎng)基5.0 g，加入蒸餾水25 mL，25 ℃下恒溫?fù)u床以150 r/min浸提4 h，5 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，取上清液為待測(cè)酶樣。

觀察發(fā)霉洞穴數(shù)。

1.6酶活測(cè)定[7]

1.6.1LAC活性測(cè)定

取13.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺（用95%乙醇溶解）0.5 mL作為底物，加入0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH值為4.6）3.4 mL、0.5 mL酶液，28 ℃下反應(yīng)30 min，于600 nm處測(cè)吸光度。另取同量酶液，沸水浴5 min滅活后作為對(duì)照。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物與底物作用3 min內(nèi)改變0.1個(gè)吸光度為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.6.2POD活性測(cè)定

取0.1 mol/L鄰苯二酚2.0 mL，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH值為6.0）2.0 mL、0.5 mL酶液，28 ℃下反應(yīng) 30 min，于400 nm處測(cè)吸光度。另取等量酶液，沸水浴5 min滅活后作為對(duì)照。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物與底物作用30 min內(nèi)改變0.1個(gè)吸光度為1個(gè)酶活性單位（U）。

16.3CMCase活性測(cè)定

在試管中加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液1.5 mL，加粗酶液1.0 mL，50 ℃ 水浴保溫30 min，取出后立即加入二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）1.5 mL，100 ℃ 水浴5 min，冷卻后加入蒸餾水定容至25 mL，混勻，測(cè)520 nm處吸光度。另取同量酶液，沸水浴5 min滅活后，作為對(duì)照。以不同濃度的葡萄糖溶液與DNS試劑反應(yīng)，測(cè)520 nm處吸光度，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.6.4FPase活性測(cè)定

采用濾紙為底物測(cè)定FPase活性，分別于酶解管中加入濾紙，0.05 mol/L檸檬酸緩沖液（pH值為4.5）1 mL，酶液1 mL，50 ℃下保溫 30 min，取出后立即加入DNS試劑1.5 mL，100 ℃水浴5 min，冷卻后加蒸餾水至 25 mL，混勻，測(cè)520 nm處吸光度。另取同量酶液，沸水浴 5 min 滅活后，作為對(duì)照。酶活性單位定義：以1 g培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活性單位（U）。

2結(jié)果與分析

2.1不同菌株的產(chǎn)量分析

由圖1可知，各菌株間產(chǎn)量有明顯差別，菌株產(chǎn)量大小排序?yàn)楹谕?號(hào)>黑威4號(hào)>981>8808>黑29，新復(fù)極差法求出各菌株間差異性，黑威2號(hào)顯著高于其他菌株（P<0.05），黑威4號(hào)、981菌株差異并不顯著（P>0.05），8808、黑29菌株產(chǎn)量最低。

2.2供試菌株的抗霉性分析

由圖2可知，各菌株抗霉能力有明顯差別，其中菌株抗霉能力大小排序?yàn)楹?9>8808>981>黑威4號(hào)>黑威2號(hào)，黑威2號(hào)、黑威4號(hào)、981菌株抗霉能力較差，8808、黑29菌株抗霉能力較強(qiáng)。用新復(fù)極差法求出各菌株間抗霉能力差異性，黑威2號(hào)、黑威4號(hào)、981菌株抗霉能力顯著低于其他2個(gè)菌株（P<0.05）。

2.3供試菌株5種胞外酶活性分析

[CM（26]2.3.1LAC活性變化

5個(gè)供試黑木耳菌株在栽培過(guò)程中

LAC活性變化如圖3所示，由圖3可知，LAC活性變化基本趨勢(shì)一致，981、黑威2號(hào)、黑威4號(hào)菌株酶活性較高，981、黑威4號(hào)酶活性最高峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)的60 d。其他菌株酶活性差別不大，酶活性相對(duì)較低的菌株有8808、黑29。各菌株酶活性峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同，5個(gè)供試黑木耳菌株酶活性高峰均出現(xiàn)在培養(yǎng)的60 d左右，培養(yǎng)30 d以后，酶活性高峰有所波動(dòng)。

2.3.2POD活性的變化

在栽培過(guò)程中，5個(gè)供試菌株的POD活性有升有降，但總體上呈逐漸上升趨勢(shì)（圖4）。圖4中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，981、黑威2號(hào)、黑威4號(hào)菌株酶活性較高，50 d以后981、黑威4號(hào)菌株酶活性有所降低，黑威2號(hào)酶活性在培養(yǎng)的60 d達(dá)到最大。8808、黑29菌株酶活性相對(duì)較低，在培養(yǎng)的20 d達(dá)到最高峰，之后一直維持在較低的水平。

2.3.3CMCase活性變化

CMCase酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，隨后有所降低，降到一定低水平時(shí)酶活性又有所升高，呈有交替性的升高下降趨勢(shì)。圖5顯示，981、黑威2號(hào)、黑威4號(hào)菌株酶活性較高，黑威2號(hào)、黑威4號(hào)酶活性在培養(yǎng)的30 d達(dá)到第1個(gè)高峰，培養(yǎng)的50 d達(dá)到第2個(gè)高峰，之后酶活性最高峰交替波動(dòng)。8808、黑29菌株酶活性相對(duì)較低，最高峰出現(xiàn)得比較早，在培養(yǎng)的30 d達(dá)到最高峰，之后一直維持在較低的水平，在培養(yǎng)的時(shí)間內(nèi)酶活性變化不大。

2.3.4FPase活性變化

栽培過(guò)程中FPase活性變化如圖6所示，隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)，981、黑威2號(hào)、黑威4號(hào)FPase活性迅速升高，而后其峰值交替出現(xiàn)。8808、黑29菌株酶活性相對(duì)較低，變化幅度也相對(duì)較小，20 d以后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，在前60 d表現(xiàn)為黑29>8808，60 d以后表現(xiàn)為黑 29>8808。

2.4不同菌株胞外酶相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示（表1），供試菌株間產(chǎn)量與 CMCase、FPase、LAC活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與抗霉性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；抗霉性與CMCase活性呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與FPase、LAC、POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；LAC活性與 CMCase、FPase、POD活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；POD活性與CMCase、FPase活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；CMCase 活性與FPase活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

3結(jié)論與討論

在黑木耳栽培過(guò)程中研究各菌株胞外酶活性變化規(guī)律，了解其在整個(gè)發(fā)育階段的分泌特點(diǎn)、活性大小、變化規(guī)律，推測(cè)其在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)培養(yǎng)基中木質(zhì)纖維素等大分子營(yíng)養(yǎng)成分的降解動(dòng)態(tài)，對(duì)提高培養(yǎng)料利用率有重要意義[5-7]。此外，黑木耳栽培過(guò)程中合成的各類(lèi)酶，可使大分子物質(zhì)降解生成葡萄糖并被食用菌利用，生成各類(lèi)有機(jī)活性物質(zhì)。研究各[CM（25]菌株在菌絲生長(zhǎng)各階段（母種、原種、栽培種）的酶活性變

化規(guī)律，找出各菌株在培養(yǎng)過(guò)程中酶活性的變化特點(diǎn)，建立各菌株酶活性變化規(guī)律基本圖譜，繪制某些特定菌株的特定酶活性曲線，了解其酶學(xué)基礎(chǔ)用于菌株的鑒定工作[7]。本試驗(yàn)研究顯示，被測(cè)各菌株酶活性變化存在一定的規(guī)律性，這一變化規(guī)律表明菌株正常生長(zhǎng)的活力。當(dāng)測(cè)定的酶活性及變化規(guī)律發(fā)生大改變時(shí)，就應(yīng)該考慮停止使用該菌株，并進(jìn)行栽培試驗(yàn)測(cè)試，以檢測(cè)該菌株是否發(fā)生栽培性狀的改變。

木質(zhì)素分解能力與食用菌代謝過(guò)程中合成的木質(zhì)素分解酶有關(guān)，LAC、POD是目前公認(rèn)的木質(zhì)素分解酶之一，它能在O2存在的條件下脫去羥基上的電子或質(zhì)子形成自由基，導(dǎo)致酚型木質(zhì)素側(cè)鏈脫羧或脫氫，造成C—C鍵斷裂，從而降解木質(zhì)素[2-3]。LAC、POD是與木質(zhì)素等大分子物質(zhì)降解有關(guān)的酚氧化酶，它能加速木質(zhì)素等芳香族高分子化合物的分解[8-11]。本研究表明，原種培養(yǎng)基中存在豐富的木質(zhì)素作用底物，黑木耳菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中可向基質(zhì)中源源不斷地分泌LAC、POD等木質(zhì)素酶，當(dāng)培養(yǎng)菌絲產(chǎn)生的酶積累到一定水平時(shí)，表現(xiàn)為酶活性升高，激發(fā)酶與底物結(jié)合降解木質(zhì)素，生成小分子而被菌絲生長(zhǎng)利用，酶與底物結(jié)合后酶活性下降，菌絲生長(zhǎng)。在酶活性監(jiān)測(cè)的過(guò)程中，隨酶活性的升高而降低，能較清晰地看到酶與底物之間的相互作用，這種作用的高低強(qiáng)弱與菌株自身分解基質(zhì)能力有關(guān)，在檢測(cè)中如果發(fā)現(xiàn)某些菌株的酶活性發(fā)生異常，就應(yīng)停止該菌株的大規(guī)模生產(chǎn)使用，并進(jìn)行栽培試驗(yàn)檢測(cè)。

黑木耳栽培過(guò)程中各菌種以分解基質(zhì)中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素來(lái)滿足其生長(zhǎng)繁殖所需要的營(yíng)養(yǎng)，而這些大分子物質(zhì)須在纖維素酶的作用下才能夠分解，培養(yǎng)基中存在大量的纖維素。CMCase是一種誘導(dǎo)酶，隨著菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，菌絲細(xì)胞分泌的胞外CMCase逐漸增多，因此CMCase活性隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加。LAC、POD活性是與木質(zhì)素等大分子物質(zhì)降解有關(guān)的酶，本研究顯示，LAC、POD活性隨著栽培時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，與前人的研究結(jié)果[5-7，12-14]一致。試驗(yàn)中5個(gè)黑木耳菌株的CMCase、FPase、LAC、POD活性在菌絲生長(zhǎng)期較低，隨著子實(shí)體的形成和成熟而逐漸增高，這符合木質(zhì)素類(lèi)物質(zhì)優(yōu)先利用的推斷。5個(gè)供試菌株中，黑29產(chǎn)量一般，而本試驗(yàn)測(cè)定的4種胞外酶活性中該菌株也相對(duì)較低，分析低酶活性可能與該菌株退化有關(guān)。

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