木霉菌可濕性粉劑藥效的提高技術

田連生+陳菲

摘要：為提高木霉菌可濕性粉劑防效和藥效速度，對影響木霉分生孢子萌發的不同因子進行研究。結果表明，蛋白胨、酵母粉和乳糖、蔗糖等對木霉孢子萌發均有顯著的促進作用，溫度25～30 ℃、pH值 4～6和飽和濕度環境是孢子萌發的適宜條件。木霉孢子在水中萌發率很低，光照對孢子萌發無顯著影響；孢子萌發率和萌發速率是影響木霉可濕性粉劑生防效果和藥效速度的主要原因。室內離體防效試驗結果也證明，添加0.4%蛋白胨和乳糖，調節pH值至5，3 d時對黃瓜灰霉病防效可達85.6%，而未作處理的藥液7 d防效才達84.2%。本研究結果也對該產品的生產和田間應用提出了改進建議。

關鍵詞：木霉菌；分生孢子；萌發條件；萌發率；可濕性粉劑；影響因子；生防效果；室內離體防效

中圖分類號： S476文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0097-03

生物農藥特別是活體生物農藥對農作物病害的防治作用，除與其代謝產物有關外，還與活體微生物的生物學特性有更加密切的關系。一般生物農藥具有藥效緩慢、易受環境因素制約、防效不穩定等缺點，這些都不利于活體微生物農藥的使用和推廣。木霉菌（Thichoderma spp.）由于具有多重的生防機制和良好的防治效果越來越受到人們的重視。目前，已有商業化產品——木霉菌可濕性粉劑出售。木霉分生孢子為木霉可濕性粉劑的有效成分，其孢子生物學特性及孢子萌發條件是影響木霉菌發揮其生防作用的首要條件。因為木霉菌對植物病原菌的生防機制主要是競爭、重寄生和抗生素作用[1-5]。而前2個影響因子均與木霉分生孢子萌發有著密切關系。因此，研究木霉分生孢子萌發相關影響因子[6-8]，提高其孢子萌發率和萌發速度，就可提高木霉菌可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。本研究結果無論是對廠家生產產品，還是農民在田間應用該生物農藥防治農作物病害均具有重要的指導意義。

1材料與方法

1.1供試材料

木霉菌可濕性粉劑（2億個/g），山東泰諾藥業有限公司；50%多菌靈可濕性粉劑，日本住友化學株式會社；灰葡萄孢菌（Botrytis cinera），由筆者所在實驗室從感染灰霉病的黃瓜上分離、純化得到。

1.2不同氮源對孢子萌發的影響

將一定量的木霉菌可濕性粉劑加入0.4%蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉浸膏等有機氮源溶液中，制成100萬個/mL孢子懸浮液；以同樣方法配制NH4NO3、（NH4）2SO4等無機氮源的孢子懸浮液。分別取上述懸浮液0.05 mL滴于載玻片上，置于28 ℃恒溫箱中保濕培養12、24 h，觀察分生孢子萌發情況，每處理重復3次，計算孢子萌發率，同時用無菌水制成相同濃度的孢子懸浮液作空白對照。孢子萌發率=萌發孢子平均數/（ 萌發孢子平均數+未萌發孢子平均數）×100%。

1.3不同碳源對孢子萌發的影響

將木霉可濕性粉劑分別用0.4%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉溶液稀釋成100萬個/mL孢子懸浮液。按“1.2”節方法進行處理，計算孢子萌發率。

[HTK]1.4溫度對孢子萌發的影響[HT]

取一定量木霉可濕性粉劑，分別用0.4%蛋白胨溶液和無菌水稀釋為含孢子濃度100萬個/mL的懸浮液，各取 0.05 mL 滴于萌發載玻片上，分別置于10、20、25、28、30、40 ℃ 不同溫度培養箱中培養24 h，鏡檢孢子萌發情況，每處理重復3次，計算孢子萌發率。

1.5相對濕度對孢子萌發的影響

將木霉可濕性粉劑用0.4%蛋白胨溶液配制成孢子濃度為100萬個/mL 懸浮液，取 0.05 mL滴于載玻片上快速風干，置于人工氣候箱中，分別在80%、90%、95%、100%相對濕度下作孢子萌發試驗，每處理重復3次，培養24 h后鏡檢孢子萌發情況，計算孢子萌發率。

1.6pH值對孢子萌發的影響

取木霉菌可濕性粉劑，用0.4%蛋白胨溶液稀釋為100萬個/mL 懸浮液，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl溶液調節溶液pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9，各取 0.05 mL溶液滴于載玻片上，置于28 ℃培養箱中保濕培養，24 h后鏡檢孢子萌發情況，每處理重復3次，計算孢子萌發率。

1.7光照對孢子萌發的影響

用0.4%蛋白胨作營養液制成100萬個/mL木霉孢子懸浮液，取 0.05 mL滴于載玻片上，在光照和黑暗條件下于 28 ℃ 恒溫培養24 h，鏡檢孢子萌發情況，每處理重復3次。

[HTK]1.8室內離體防效測定[HT]

采用離體葉片法[9]測定防效。選取健康無病的黃瓜葉片，剪下后用無菌水反復沖洗，先噴濃度為0.1億個/mL的灰霉菌孢子懸浮液，保溫培養1 d后再噴A（用0.4%蛋白胨和乳糖溶液把木霉可濕性粉劑稀釋成500倍液，并用0.1 mol/L HCl溶液調節pH值到5）、B（用無菌水把木霉可濕性粉劑稀釋成500倍液）、C（用等量無菌水作空白對照）3個處理藥液；葉柄用脫脂棉纏繞，滴加0.5%葡萄糖無菌液，置于培養皿內，于25 ℃下保溫保濕培養；每個處理10張葉片，重復3次，分別在培養后3、7 d調查葉片病情指數，并計算防治效果。其中病情指數分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個葉面積的5%以下；2級，病斑面積占整個葉面積的 6%～10%；3級，病斑面積占整個葉面積的11%～25%；4級，病斑面積占整個葉面積的26%～50%；5級，病斑面積占整個葉面積的50%以上。病情指數=100×∑（各級病葉數×相應級數）/（調查總葉數×最高級級數）；防治效果=（對照病情指數-用藥病情指數）/對照病情指數×100%。

2結果與分析

2.1不同氮源對孢子萌發的影響

由圖1可見，有機氮源對木霉分生孢子萌發促進作用明顯，在蛋白胨溶液中培養后12 h，萌發率即可達到87.56%；培養后24 h，達88.62%，在牛肉膏和酵母粉溶液中培養也達到75.2%和79.1%。而無機氮源促進作用較弱，只有（NH4）2SO4溶液中達到46.6%，NH4NO3達到30.5%。說明有機氮源對孢子萌發有明顯的促進作用。木霉分生孢子在水中培養12 h沒有萌發，培養24 h也只有15.3%，培養后 152 h 萌發率僅達到80%。由此可見，木霉孢子在純水中萌發率低，萌發速度慢，這也是導致其藥效緩慢的主要原因。

2.2不同碳源對孢子萌發的影響

碳源對木霉孢子萌發促進的作用不如氮源明顯。由圖2

可知，乳糖對孢子萌發促進作用較大，培養后24 h，萌發率達到32.8%；蔗糖次之，為27.9%；麥芽糖和葡萄糖對孢子萌發促進作用較小，萌發率分別為19.6%和16.7%；可溶性淀粉則對孢子萌發基本無促進作用。木霉孢子在無菌水中培養12 h未萌發，培養24 h萌發率只有15.5%。

2.3溫度對孢子萌發的影響

溫度對木霉孢子萌發作用明顯。由表1可以看出，木霉孢子在10～40 ℃均可萌發。開始時，隨著溫度升高，孢子萌發率逐漸升高；但28 ℃后，孢子萌發率呈下降趨勢。可見孢子萌發適宜溫度為25～30 ℃，在此溫度條件下孢子萌發率較高，且芽管生長旺盛。而在無菌水中的孢子萌發率均較低。

木霉孢子萌發需要高濕環境。由圖3可見，木霉孢子在相對濕度為80%的條件下培養24 h不萌發；相對濕度為90%時，孢子萌發率達到13%；相對濕度為95%時，萌發率為55.2%；而在液滴中孢子萌發率高達88.8%。表明木霉分生孢子萌發率與相對濕度呈正相關性。

2.5pH值對孢子萌發的影響

pH值對孢子萌發作用明顯（圖4），pH值為2～9范圍內，木霉孢子均能萌發，其中以pH值為5時萌發率最高，24 h

達到87.8%；適宜pH值為4～6，萌發率均達到80%以上。而當pH值<3或>7時，萌發率則明顯下降。說明木霉孢子在弱酸性條件下萌發較好，而堿性或強酸性時均不適于孢子萌發。

2.6光照對孢子萌發的影響

連續光照24 h后，木霉孢子萌發率為87.1%；避光黑暗處理24 h后，萌發率為86.7%，2個處理無明顯區別，說明光照對木霉孢子萌發沒有明顯作用。

2.7室內離體防效試驗

由室內防治效果（表2）可以看出，碳源、氮源的加入與適宜的pH值確實可以提高木霉可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。培養3 d時，A處理的防治效果已達到85.6%，與培養7 d的防效比較接近；而B處理在培養3 d時的防效只有677%，培養7 d時也只達到84.2%。進一步驗證了添加少量的氮源、碳源和調整藥液適宜pH值，可提高木霉可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。

3討論與結論

本試驗就氮源、碳源、溫度、pH值、相對濕度和光照6個因素對木霉分生孢子萌發的影響進行研究，結果表明，有機氮源蛋白胨、牛肉膏和酵母粉等對孢子萌發有較好的促進作用，而無機氮源作用不大；碳源及光照對木霉孢子萌發促進作用不明顯；適宜溫度為25～30 ℃、pH值為4～6，這與木霉屬的菌落生長特性相一致。試驗結果與高克祥等的研究結論[6-7]基本一致。為了進一步驗證試驗結果，本研究還通過室內離體防效試驗，在配制木霉可濕性粉劑藥液時添加04%蛋白胨和乳糖，并調pH值至5，對黃瓜灰霉病的防效和作用速度明顯優于純水配制的藥效。為了增加活體生物農藥的藥效速度、提高防治效果，生產廠家在配制產品以及農民在使用木霉菌劑時應注意以下幾點。

3.1合理添加碳氮元素

根據“2.1”“2.2”“2.5”節試驗結果，廠家在配制產品時可添加少量蛋白胨粉或酵母粉和蔗糖等物質，在不影響農藥質量前提下，盡量選擇酸性助劑；農民在噴施木霉可濕性粉劑時，也可在水中添加少量硫酸銨、蔗糖等，還可加少量食醋降低藥液pH值。

3.2選擇施藥時間

根據“2.3”“2.4”“2.6”節試驗結果，在春秋季節噴施農藥時應選擇在氣溫較高的中午進行，這樣夜里相對濕度大，從而有利于孢子萌發；但夏季中午溫度較高，藥液很容易被蒸發而減少相對濕度，所以應在16：00后或陰天時進行噴施；在冬季溫室大棚中使用時，中午施藥不但棚內溫度高，相對濕度也大，更利于木霉孢子萌發。總之，應根據季節和天氣情況選擇適宜的時間施藥，才能提高藥效，減少環境因素對活體生物農藥的藥效影響。

木霉菌可濕性粉劑是活體生防菌劑，研究其分生孢子萌發的影響因子，對生產廠家配制藥劑和農民田間應用都具有重要的指導意義。有關木霉可濕性粉劑在植物病害防治的微生態環境及其分生孢子萌發和在植物葉面上的定殖條件等影響因子，都有待進一步深入研究。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻：

[1]易茜茜，丁萬隆，李勇. 木霉菌及其對植物病真菌病害的防治機制[J]. 中國農學通報，2009，25（20）：228-231.

[2]Ahmed S A，Sanchez C P，Candela M E. Evaluartion of induction of systemic resistance in pepper plants to Phytophthora capsici using Trichoderma harzianum and its relation with capsidiol accumulation[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106：817-824.

[3]Papavizas G C，Lumsden R D.Biological control of soilborne fungal propagules[J]. Ann Rev Phytopathology，1980，18：389-413.

[4]陳立華，金秋，牛明，等. 棘孢木霉對水稻紋枯病病原菌立枯絲核菌生物防治的研究[J]. 江蘇農業科學，2015，43（5）：115-117.

[5]孫勇，蔣繼宏，張海燕. 植物內生木霉的鑒定及其抑菌活性[J]. 江蘇農業科學，2015，43（2）：332-333.

[6]高克祥，劉小光，陳晉江，等. 木霉菌株T95生物學特性的研究[J]. 河北林果研究，1998，13（4）：359-365.

[7]紀明山，李博強，許遠，等. 綠色木霉TR-8菌株的生物學特性研究[J]. 沈陽農業大學學報，2004，35（3）：195-199.

[8]王芊. 木霉菌株BTW41分生孢子萌發條件研究[J]. 黑龍江農業科學，2002（5）：5-6.

[9]方中達. 植病研究方法[M]. 北京：農業出版社，1979.