結直腸癌中微衛星不穩定性與PD-L1表達的關系及臨床意義

馮穩 吳新新 郭永軍 常玉喜 夏慶欣

·臨床研究與應用·

結直腸癌中微衛星不穩定性與PD-L1表達的關系及臨床意義

馮穩①吳新新②郭永軍②常玉喜②夏慶欣①

目的：研究PD-L1在結直腸癌（colorectal cancer，CRC）中的表達及臨床意義。方法：選取2015年1月至2016年1月在鄭州大學附屬腫瘤醫院接受CRC根治性手術的患者210例，分為微衛星高度不穩定（high-frequency microsatellite instability，MSI-H）、微衛星低度不穩定（low-frequency microsatellite instability，MSI-L）、微衛星穩定（microsatellite stable，MSS）3個組，采用免疫組織化學法檢測各組織標本中細胞程序性死亡配體1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表達，分析PD-L1在各型CRC中的表達特點。結果：PD-L1在低分化CRC中的表達高于中、高分化CRC（P＜0.05），PD-L1在MSI-H的CRC中陽性率為75.8%，在MSIL/MSS中的陽性率為9.3%，兩組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論：PD-L1在部分CRC癌組織中陽性表達，尤其是在MSIH的CRC陽性率顯著高于MSI-L及MSS的CRC。PD-L1阻斷劑對MSI-H的CRC患者療效可能更好。

PD-L1 結直腸癌 免疫組織化學 臨床意義

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，目前其發病率居全球所有惡性腫瘤的第3位，在中國的發病率也呈逐步上升趨勢［1-2］。除了傳統的手術和放化療，近年來分子靶向治療在特定患者人群中表現出顯著的療效。細胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）能夠抑制T細胞的活化與增殖，誘導T細胞凋亡，從而維持機體的免疫平衡，避免自身的免疫損傷［3-4］。PD-L1抗體可用于治療多種惡性腫瘤如非小細胞肺癌、卵巢癌等［4-6］。本研究探討PD-L1在CRC中的表達及臨床意義，以期為PD-L1在結直腸癌個體化精準治療的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2015年1月至2016年1月在鄭州大學附屬腫瘤醫院接受CRC根治性手術的患者210例臨床資料，手術前均未接受任何治療，排除標準：遺傳性腺瘤性息肉病及遺傳性非息肉性結直腸癌患者。入組患者手術石蠟組織標本，包括210例腫瘤組織、50例癌旁正常組織（距離癌變組織邊緣直徑＞5 cm，術后切緣病理未見腫瘤細胞）。本研究得到鄭州大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。入組患者的基本資料：男性118例，女性92例；年齡31～85歲，平均年齡63.5歲；右半結腸（升結腸和右半橫結腸）43例，左半結腸（左半橫結腸，降結腸和乙狀結腸）32例，直腸135例。病理分期標準按照美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯盟（UICC）結直腸癌第7版TNM分期標準［7］。

1.1.2 取材和病理切片的制備 手術切除新鮮結直腸組織標本后送病理科，每例患者留取癌組織及癌旁組織標本各一塊，以10%福爾馬林固定溶液固定24 h以上，制備石蠟包塊，制作連續切片厚度4 μm，分別常規以蘇木素-伊紅（HE）染色、PD-L1免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2 方法

1.2.1 MSI的檢測 本研究使用MSI檢測試劑盒檢測貝斯塔遺傳標記（Bethesda Marker）：Bat25、Bat26、D5S346、D2S123和D17S250共5個位點，正向引物標記熒光，對同一患者的腫瘤組織和正常黏膜組織的DNA進行PCR擴增，再用毛細管電泳檢測擴增的產物，判斷檢測的腫瘤組織和正常黏膜組織是否存在微衛星不穩定性。5對引物來自美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因庫，上游引物5'端分別作3種不同顏色的熒光標記。相對分子量標準采用美國ABI公司的GS-500LIZ Size Standard內標。同色引物擴增產物長度有別，可同時對多個位點進行片段分析，引物序列見表1。

1.2.2 免疫組織化學染色法 切除的組織標本用甲醛溶液固定，石蠟包埋，組織切片的厚度為4 μm，將其置于玻璃片上，用二甲苯脫蠟，在梯度乙醇內水化，在900 W微波加熱2 s，進行抗原修復后，于0.3%的H2O2液中浸泡30 min阻斷內源性抗原，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次，用10%正常的血清阻斷背景非特異性的染色，加一抗置于濕盒內孵育過夜。一抗為兔抗人PD-L1單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），1:100稀釋。生物素包被的鼠抗兔抗體孵育30 min后使用PBS洗3次，再用親和素-生物素-過氧化物酶復合物孵育30 min，然后使用蘇木素復染。以正常小鼠的IgG代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學結果判讀標準 本研究使用免疫組織化學SP法檢測PD-L1在CRC癌組織中的表情況，參考楊軍等［8］的免疫組織化學檢測結果判讀方法對結果進行判斷統計。免疫組織化學切片由病理科醫師判讀，PD-L1定位于腫瘤細胞膜或細胞漿，當所觀察指標定位部位出現棕黃色顆粒為陽性表達。直接計算陽性細胞數（或面積）占視野下或整張切片內同類細胞數（或面積）的百分比進行分級。陰性（0）：無著色；弱陽性（+）：任何比例的細胞呈現微弱、不完整膜著色；陽性（++）：＞10%的細胞呈現弱至中等強度、完整但不均勻膜棕黃著色；強陽性（+++）：＞30%的細胞呈現強、完整膜棕褐著色。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，定性資料分析方法主要使用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MSI在CRC中的檢測結果

與正常結直腸黏膜對比，210例CRC癌組織標本中MSI-H的發生率為13.3%，MSI-L的發生率為0.9%，MSS的發生率為85.7%，其中28例MSI-H的CRC同時存在Bat26與Bat25的位點改變，10例存在D2S123位點的改變，11例存在D17S250位點的改變，4例存在D5S346位點的改變，只有2例5個位點均存在改變（表2）。

2.2 PD-L1在CRC癌組織與癌旁正常組織中的表達

PD-L1在CRC癌組織的陽性率為18.6%，對照組的50例癌旁正常黏膜PD-L1陽性率為6.0%，統計分析顯示PD-L1在CRC中腫瘤組織的陽性率高于癌旁正常組織（P＜0.05，表3，圖1）。

表1 MSI引物及特征Table 1 MST primers and characteristics

表1 MSI引物及特征（續表1）Table 1 MSI primers and characteristics

表2 CRC的MSI檢測結果Table 2 Detection of MSI in CRC

表3 PD-L1在CRC中腫瘤組織與癌旁組織中的表達Table 3 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

2.3 PD-L1與CRC臨床病理特征的相關性

分析顯示PD-L1在CRC中的表達與性別、年齡、淋巴結轉移、腫瘤部位、組織學類型、浸潤深度和病理分期之間差異無統計學意義（P＜0.05）；僅在分化程度上差異具有統計學意義（表4，P＜0.05）。

2.4 PD-L1在MSI-H的CRC和MSI-L/MSS的CRC中的表達情況

在MSI-H的CRC中，PD-L1陽性率為75.8%；在MSI-L/MSS的CRC中，PD-L1陽性率為9.3%，兩組比較差異具有統計學意義（表5，P＜0.05）。

圖1 PD-L1在CRC癌組織與癌旁正常組織中的表達Figure 1 Expression of PD-L1 in cancer and paracancer tissues of CRC

表4 PD-L1與CRC的臨床病理特征關系Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表4 PD-L1與CRC的臨床病理特征關系（續表4）Table 4 Relationship of PD-L1 with clincopathological characteristics of CRC

表5 PD-L1在MSI-CRC中的表達Table 5 Expression of PD-L1 in MSI-CRC

3 討論

CRC是全球常見的消化道惡性腫瘤，與西方國家相比，CRC在中國的發病率相對較低，但是隨著社會經濟的發展、生活環境的改變、人民生活習慣的變化等，該病在國內的發病率逐年上升，且趨于年輕化［9］。因此，研究CRC的發病機制、治療和預防，對降低CRC的發病具有重要的臨床價值。近幾年來，隨著對腫瘤發病機制的研究不斷深入，對癌基因和抑癌基因的進一步了解，CRC的治療已經從外科治療為主、放化療為輔的綜合治療轉向了精準化、個體化治療理念，應運而生的生物治療、基因治療、免疫治療越來越受到重視［10-13］。

本研究結果顯示，PD-L1在癌組織與正常組織之間表達存在顯著性差異，PD-L1在癌組織中均存在陽性表達率升高。PD-L1在CRC表達的臨床病理特征僅與分化程度相比差異具有統計學意義（P＜0.05）。

PD-L1在MSS的CRC中，PD-L1的陽性表達與MSS的CRC有無淋巴結轉移無關（P＞0.05），與病理分期無關（P＞0.05），但PD-L1在分化程度低的MSS的CRC中陽性率顯著高于中、高分化組（P＜0.05）。

進一步分析發現PD-L1在MSS的CRC中陽性表達率為9.3%，而Droeser等［14］研究顯示，PD-L1在MSS的CRC中表達率為37%，造成這種差異的原因，可能是入組病例數量過少，但在PD-L1表達與腫瘤的低分化，缺少淋巴結轉移等臨床病理特征與本研究相同，而對于病理分期早的特點在本研究中并未得出相同的結論。

PD-L1是細胞毒性免疫應答的關鍵抑制劑，腫瘤細胞上PD-L1的表達可以被免疫微環境誘導，導致腫瘤的免疫逃避以及預后不良。Llosa等［15］研究發現，在CRC的免疫微環境中富含活化的Th1、CTL（細胞毒性T淋巴細胞），在錯配修復中存在缺陷，為了平衡這種活性Th1/CTL的微環境，MSI CRC選擇性地上調某些免疫檢查點的表達，其中就包括有PD-L1。Rosenbaum等［16］對結直腸癌的研究發現，PD-L1抑制反應與微衛星不穩定性相關。本研究中，MSI-H的CRC患者癌組織中PD-L1中呈高表達（PD-L1陽性為75.8%），與上述研究成果一致，同時進一步證實了Li等［17］的研究結果，即PD-L1與CRC患者的預后有關。雖然目前國內的相關研究較少，但是本研究結果為這一設想提供了理論依據，且相關的臨床研究仍在繼續開展中。

綜上所述，本研究對PD-L1在結直腸癌中的表達進行了初步研究，證實PD-L1在部分CRC癌組織中陽性表達，尤其是在MSI-H的CRC患者中其陽性率顯著高于MSI-L及MSS的CRC。根據本研究結果推論，在臨床實踐中，PD-L1阻斷劑對MSI-H的CRC患者療效可能更好。

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（2017-01-13收稿）

（2017-06-22修回）

Relationship between expression of PD-L1 and microsatellite instability of colorectal cancer and its significance

Wen FENG1,Xinxin WU2,Yongjun GUO1,Yuxi CHANG1,Qingxin XIA1

Qingxin XIA;E-mail:13838173710@139.com
1Department of Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China;2Departrment of Molecular Pathology,The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450003,China

Objective:To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 in colorectal cancer(CRC).Methods:A total of 210 CRC patients who accepted radical surgery in our hospital from January 2015 to January 2016 were divided into three groups,namely,high-frequency microsatellite instability(MSI-H),low-frequency microsatellite instability(MSI-L),and microsatellite stable(MSS).The expression of PD-L1 was detected by immunohistochemistry,and the expression characteristics of PD-L1 in different types of CRC were analyzed.Results:CRC cases with low differentiation had a higher expression of PD-L1 than CRC patients with high differentiation(P＜0.05).PD-L1 had a positive rate of 75.8%in the MSI-H group and a rate of 9.3%in the MSI-L and MSS groups,wherein the difference between the two groups was statistically significant(P＜0.05).Conclusion:PD-L1 was positively expressed in some CRC tumor tissues,and its positive rate was significantly higher in MSI-H than in MSI-L and MSS.The therapeutic effect of a PD-L1 blocker for patients with MSI-H CRC might be preferable.

PD-L1,colorectal cancer,immunohistochemistry,significance

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.055

①鄭州大學附屬腫瘤醫院（河南省腫瘤醫院）病理科（鄭州市450003）；②分子病理科

夏慶欣 13838173710@139.com

馮穩 專業方向為消化道和胸部腫瘤的病理研究與診斷。

E-mail：manfengwen@126.com