祛風活血丸對EAU大鼠模型TGF-β2表達的影響

喻京生，肖霞，李維，龍輝，易妙

祛風活血丸對EAU大鼠模型TGF-β2表達的影響

喻京生1，肖霞2，李維2，龍輝2，易妙2

目的通過觀察祛風活血丸對實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型葡萄膜TGF-β2表達的影響，探討祛風活血丸對EAU模型大鼠的治療效果。方法將60只Lewis大鼠隨機分為6組，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、祛風活血丸低、中及高劑量組，每組10只。空白對照組不作處理，其余均予以右后足墊注射光感受器間維生素A類結合蛋白多肽片斷（IRBP），建立EAU大鼠模型，造模成功后進行灌胃。空白對照組與模型對照組予以蒸餾水灌胃，祛風活血丸低、中、高劑量組分別予以不同劑量祛風活血丸灌胃，陽性對照組予以熊膽開明片灌胃。分別于灌胃后第7、14、21、28 d分批處死大鼠，取眼球做免疫組化，檢測TGF-β2的表達。結果TGF-β2免疫組化：各時間點模型對照組與空白對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.01）；祛風活血丸各組大鼠與空白對照組相比，葡萄膜TGF-β2含量明顯降低，各時間點差異均有統計學意義（P<0.01），其中以中、高劑量組最為明顯；低劑量組于給藥后第7及21 d差異有統計學意義（P7<0.01；P21<0.05）；第14及第28 d差異無統計學意義（P>0.05）；陽性對照組于給藥后各時間點差異均有統計學意義（P14,21<0.01；P7,28<0.05）。結論祛風活血丸能通過調節免疫因子TGF-β2的狀態，對大鼠葡萄膜炎發揮一定程度的治療作用。

自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型；祛風活血丸；轉化生長因子β；葡萄膜炎

葡萄膜炎是一組累及葡萄膜、視網膜、玻璃體及視網膜血管的炎性病變，多發生于青壯年，易合并全身性自身免疫性疾病，常反復發作，治療棘手，可引起一些嚴重并發癥。本研究旨在采用具有祛風清熱，養血活血作用的祛風活血丸，作用于實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，運用相關的免疫組織化學法檢測大鼠葡萄膜TGF-β2的表達，通過觀察TGF-β2對免疫調節的作用，從而探討祛風活血丸防治葡萄膜炎的機制和療效，為其治療葡萄膜炎提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：取健康6~8周齡，體重150~180 g Lewis大鼠（由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供）60只，雌雄各半，經檢查無眼疾。實驗中所有涉及到實驗動物的過程，均遵循湖南省實驗動物管理辦法。實驗動物喂養要求：（1）動物實驗室環境的溫度保持在22-25℃；（2）標準飼料和滅菌用水喂養，可自由飲水和飲食；（3）保持正常光照-黑暗周期，并盡量避免強光和噪音的刺激；（4）實驗操作時，取放動物輕柔，小心操作。

實驗藥物：祛風活血丸由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供（批號：20140917），120 g/瓶。主要藥物組成：熟地黃20 g、當歸15 g、川芎6 g、柴胡10 g、黃芩10 g、杭菊花10 g、防風10 g、魚腥草20 g。熊膽開明片（國藥準字：Z19990029）：吉林長白山藥業集團股份有限公司生產，產品批號：141101。

1.2 分組及給藥

采用隨機數字法分為6組，每組10只。分別為：空白對照組，模型對照組，陽性對照組，祛風活血丸低、中及高劑量組。空白對照組及模型對照組予以等劑量蒸餾水灌胃，每日2次，陽性對照組予以熊膽開明片成人等效劑量0.5 g/kg·d灌胃，祛風活血丸低、中、高劑量組分別予以2 g/kg·d、3 g/kg·d、4 g/kg·d灌胃。分別于灌胃后第7、14、21及28 d分批處死動物，每次每組處死2只。每組剩余的2只大鼠于第30 d以內毒素誘發復發葡萄膜炎后處死。

1.3 造模方法

以1mg IRBP粉劑與1ml PBS混合調制成濃度為1mg/ml的含IRBP的PBS溶液，放置備用。以5 ml注射器連接三通閥，分別注入0.6ml含IRBP的PBS溶液，1.4ml單純PBS溶液，2ml完全弗氏佐劑，反復推注直到充分乳化，制成4ml混合乳劑。常規消毒后，空白對照組不作處理，其余各實驗組大鼠右后足墊中部皮下進針，緩慢推注0.2ml的混合乳劑，使得每只大鼠的IRBP最終免疫量約30μg，出針并按壓進針處[1]。空白組大鼠右后足墊注射等劑量無菌生理鹽水。

1.4 觀察指標

一般指標：每天于同一時段在裂隙燈下觀察大鼠眼前節改變：如結膜充血水腫，角膜緣血管充血，虹膜血管擴張，前房滲出，晶狀體前囊灰白色絮狀沉著物，虹膜后粘連，瞳孔膜閉，玻璃體混濁等情況。評分標準參照Caspi臨床分級進行評分[2]：0分：無炎癥，視網膜紅光反射正常；0.5分：虹膜血管輕度擴張、充血；1分：虹膜血管中度充血，瞳孔縮小；2分：前房輕度混濁，紅光反射減弱；3分：前房中度混濁，但仍可見瞳孔，眼底紅光反射暗淡；4分：前房重度混濁（積膿），瞳孔膜閉，視網膜紅光反射消失，眼球前突。

采用pv-9000二步法免疫組化檢測葡萄膜中TGF-β2的表達：用頸椎脫臼法處死大鼠后，用食指和大拇指捏住大鼠頭部，使眼球自然突出，用眼科無齒鑷夾住眼球后視神經位置，用小彎剪沿無齒鑷后緣迅速剪下眼球，放入固定液內進行固定，并于2h后剪開角鞏膜緣，向球內注射少許固定液固定24 h，取出放入10%甲醛溶液中72 h，脫水浸蠟，石蠟包埋后連續切片。HE染色后使用pv-9000二步法免疫組化檢測試劑盒進行檢測。

1.5 統計學方法

采用SPSS17.0進行統計分析，采用單因素方差分析進行兩兩比較；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

每天于裂隙燈下觀察，參照Caspi臨床分級進行評分，造模第4d，臨床評分為0.48±0.03；造模第5 d為0.60±0.04；第6 d為1.04±0.09；第7 d為1.90± 1.66。采用單因素方差分析，P=0.001,組間差異有統計學意義；兩兩比較：第4與第5 d比較，P=0.257，差異無統計學意義，其余各組相比P＜0.05,差異均有統計學意義，說明造模第5 d左右成功誘發EAU模型。

2.2 TGF-β2的表達

免疫組化法檢測：各時間段空白對照組無明顯TGF-β2表達，模型對照組TGF-β2表達明顯增多，陽性對照組及祛風活血丸低劑量組隨著時間變化TGF-β2表達輕度減少，祛風活血丸中劑量組及高劑量組隨著時間變化TGF-β2表達明顯減少（圖1-圖2）。

圖1 給藥后第7d光鏡下大鼠葡萄膜TGF-β2的表達。①空白對照組大鼠葡萄膜TGF-β2表達較少，偶可見少量異染細胞；②模型對照組TGF-β2表達明顯增多，可見強陽性棕黃色陽性物質分布，含量多，顏色較深；③陽性對照組可見強陽性棕黃色陽性物質分布，顏色較深，以邊緣多見；④祛風活血丸低劑量組、⑤祛風活血丸中劑量組、⑥祛風活血丸高劑量組均可見陽性棕黃色陽性物質分布，顏色較深，分布均勻，各組差別不明顯。×200

圖2 給藥后第28d光鏡下大鼠葡萄膜TGF-β2的表達。①空白對照組大鼠葡萄膜TGF-β2表達較少，偶可見少量異染細胞；②模型對照組TGF-β2表達明顯，可見棕黃色陽性物質分布，顏色稍淡；③陽性對照組可見淡黃色陽性顆粒物質分布；④祛風活血丸低劑量組可見淡黃色陽性顆粒物質分布；⑤中劑量組邊緣部位可見少量淡黃色陽性顆粒物質分布，顏色較第7d時明顯變淡；⑥高劑量組可見少量淡黃色陽性顆粒物質分布，顏色較第7d時變淡。×200

對免疫組化的結果進行定量分析（表1）：以平均光密度值（OD）表述被測個體單位面積內吸光物質各像素光密度的平均值，由積分光密度除以測試框內像素數目獲得。OD值越大，說明測定物質的量或染色反應后顏色越深、數量越多。各組大鼠葡萄膜TGF-β2表達變化：模型組與空白組比較，葡萄膜TGF-β2含量顯著上升，各時間段差異均有統計學意義（P<0.01），說明IRBP能成功誘導實驗性自身免疫性葡萄膜炎，并可使大鼠葡萄膜組織TGF-β2含量明顯增多。各組與模型組比較：陽性對照組給藥后各時間段，TGF-β2含量逐漸下降，且幅度大，各時間段差異均有統計學意義（P<0.05），其中以第14 d及第21 d下降明顯（P<0.01）；祛風活血丸低劑量組在給藥后第7d，TGF-β2含量顯著降低（P<0.01），第21d，TGF-β2含量也有降低（P<0.05），其余時間段與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；中劑量組給藥后各時間段，TGF-β2含量顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.01）；高劑量組給藥后各時間段，葡萄膜TGF-β2含量顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05），特別是給藥后第7、21及28d下降更明顯（P<0.01）。

表1 各組大鼠葡萄膜TGF-β2光密度值（OD）分布變化ˉ±s）

表1 各組大鼠葡萄膜TGF-β2光密度值（OD）分布變化ˉ±s）

注：同時間與空白組比較，a：P<0.01。同時間與模型組比較，b：P<0.05，c：P<0.01。（單因素方差分析）

給藥后時間（d）組別714 21 28空白對照組0.165±0.005 0.135±0.005 0.170±0.010 0.145±0.005模型對照組0.665±0.015 a 0.460±0.020 a 0.405±0.015 a 0.325±0.035 a陽性對照組0.605±0.015 b 0.355±0.035c 0.270±0.010 c 0.240±0.010 b祛風活血丸低劑量組0.530±0.010 c 0.440±0.020 0.350±0.010 b 0.270±0.010祛風活血丸中劑量組0.300±0.010 c 0.255±0.005 c 0.225±0.015 c 0.170±0.010 c祛風活血丸高劑量組0.375±0.015 c 0.360±0.010 b 0.270±0.020 c 0.230±0.010 c

3 討論

在中醫學上，葡萄膜炎按其發病部位及病癥特點，分別屬于中醫“瞳神緊小”“瞳神干缺”“云霧移睛”“視瞻昏渺”“狐惑病”等范疇，其病因病機復雜，大概可分為以下幾個方面：可因肝經風熱或肝膽火熾，偱經上犯黃仁，或風濕熱邪相摶，熏蒸黃仁；或因久病傷陰，肝腎陰虧，虛火上炎，灼傷黃仁，致使瞳神持續縮小，甚至干缺不圓；也可因痰濁上泛，或濕熱蘊蒸，上攻于目；或可因肝腎陰虛，目失濡養所致。目前認為，除感染性因素外，葡萄膜炎的發病主要與免疫相關，葡萄膜在生理上具有相關的免疫學特性，是循環中免疫復合物沉積的好發部位[3]。葡萄膜富有豐富的血管和色素，分布較多的免疫活性物質，葡萄膜血管面積廣，容量大，血流緩慢，容易使血流中各種免疫介質和抗原、抗體成分在此沉積，從而引發各種免疫應答反應，并呈長期反復的過程[4]。

轉化生長因子-β（TGF-β）屬于一組新近發現的調節細胞生長和分化的TGF-β超家族蛋白，TGF-β包含多種亞型的細胞因子，主要有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，它們在結構上和功能上，對巨噬細胞、T細胞及B細胞等多種細胞產生的影響具有相似性。機體多種細胞均可分泌非活性狀態的TGF-β，但是，只有在酸性環境下通過蛋白的裂解作用才可使TGF-β復合體變為活化的TGF-β。TGF-β的生物功能包括：對多種正常的和轉化的細胞的增殖具有可逆性的顯著抑制作用，對細胞的分化具有誘導或抑制的雙重功能，可以促進細胞外基質的形成，促進傷口的愈合，抑制免疫功能等[5]。有研究發現，TGF-β在預防和治療自身免疫性葡萄膜炎中具有重要作用[6]。炎癥早期原有的潛在活性的TGF-β2及損傷部位脫顆粒釋放的TGF-β2與局部暴露的細胞外基質結合而被激活，激活的TGF-β2對白細胞、單核細胞、T細胞和成纖維細胞具有很強的趨化性[7]。目前認為，維持眼的免疫抑制環境，保持前房的免疫赦免特性與TGF-β2密切相關[8]。

在本實驗研究中我們發現，本次造模采用IRBP多肽合成片段，通過經大鼠右足后墊皮下注射抗原對實驗動物進行主動免疫的方法，成功誘發了EAU模型。起病時間在5-7 d，癥狀反應劇烈，造模成功率高，在造模第5 d左右大部分大鼠出現葡萄膜炎反應。TGF-β2在造模后大鼠葡萄膜組織切片中表達較空白對照組明顯增加，說明TGF-β2與免疫反應具有一定的相關性，其表現規律為在炎癥高峰期表達最多，炎癥消退期逐漸減少，它對白細胞等炎性細胞具有很強的趨化性，這可能與其在酸性環境下被激活，通過抑制淋巴因子和其他剌激淋巴細胞功能的因子的分化，抑制免疫活性細胞的增殖等方式達到免疫調節功能相關。低劑量組在給藥后第7及21d與模型組對比，葡萄膜中TGF-β2含量下降，差異有統計學意義，在給藥后第14及28 d時與模型組對比低劑量組TGF-β2降低幅度不明顯，差異無統計學意義，而中、高劑量組各時間段與模型組比較差異均有統計學意義，這說明祛風活血丸治療有效，但療效與藥物劑量有關，而如何找到最佳治療劑量還需要更進一步研究。本研究結果證實在EAU大鼠模型中TGF-β2呈高表達，有研究表明，TGF-β因子對細胞增殖、分化和免疫功能均有顯著的調節作用，它可抑制免疫效應細胞的增殖，抑制免疫效應細胞的分化和活性，抑制細胞因子的產生及其免疫調節作用[9]，我們推斷IRBP誘導的EAU大鼠模型出現的免疫反應紊亂可能是葡萄膜炎發生發展的一個重要因素，因此如何重建正常的免疫系統將可能為人類治療葡萄膜炎及預防其復發提供一種新的治療思路。

[1]李光達.間充質干細胞治療大鼠自身免疫性葡萄膜炎作用機制的研究[D].天津醫科大學:2012.

[2]Caspi RR.Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse[J].Curr Protoc Immunol,2003,Chapter 15:p.Unit15-16.doi: 10.1002/0471142735.im1506s53.

[3]楊培增,李紹珍.葡萄膜炎[M].北京:人民衛生出版社,1998:417.

[4]Ahn JK,Yu HG,Chung H,et al.Intraocular cytokine environment in active Behcetuveitis[J].Am JOphthalmol,2006,142（3）:429-434.

[5]葛堅，趙家良，黎曉新.眼科學[M].北京:人民衛生出版社,2010:274.

[6]張銳,錢江,袁一飛.抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體治療實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎的研究[J].中華眼底病雜志,2008,24（5）:336-339.

[7]楊碩,盧弘,陳巍.HLA-B27陽性急性前葡萄膜炎患者前房水細胞因子水平的研究[J].眼科新進展,2010,30（2）:109-111.

[8]Diaz-Llopis M,Gallego-Pinazo R,Garcia-Delpech S,et a1.General principles for the treatment of non-infectious uveitis[J].Inflamm Allergy Drug Targets,2009,8（4）:260-265．

OBJECTIVE To explore the treatmentmechanism ofQufeng Huoxue pillon experimentalautoimmune uveitis（EAU）ratsmodel by observing the influence of the pill on TGF-beta 2 expression in themodel. METHODS Sixty Lewis ratswere randomly divided into blank control group,model control group,positive control group,low dose of Qufeng Huoxue pill group,middle dose of Qufeng Huoxue pill group and high dose of Qufeng Huoxue pillgroup,whichmeant10 in each group.Rats in blank controlgroup were not intervened,while subjects in other groupswere injected with interphotoreceptor retinoid-binding protein in right rear foot pad to establish EAU model.After thatprocedure,the blank controlgroup andmodelcontrolgroup were administrated with distilled water, meantime,Qufeng Huoxue pillgroupswere treated with differentdosesofQufeng Huoxue pill respectively by gavage. The ratsweresacrificed inbatch7,14,21,28daysafter treatmentfortheireyeballstodetecttheexpressionofTGF-beta2 by immunohistochemicalprocess.RESULTSComparison of TGF-beta 2 between blank controlgroup andmodel controlgroup showed statistical significance atevery time point（P<0.01）;In contrast to blank controlgroup,TGF-beta 2 ofQufeng Huoxue pillgroupswere lower regardlessof the time point（P<0.01）,especiallywas themiddle and high dose groups.The ratuveitiswere decreased obviously after treatment,withmedium and high dose groupsweremost obviously,each time all have significantly statistical differences（P<0.01）;The Low dose group after treatmenthas significantly statisticaldifferencesatday 7（P<0.01）;ithasstatistically significantatday 21（P<0.05）;Positive controlgroup showed significantly statisticaldifferencesatday 14 and 21（P<0.01）;ithasstatistically significantatday7 and 28（P<0.05）. CONCLUSIONS The Qufeng Huoxue pill showed obviouseffects on ratsuveitis through regulating expression of the TGF-beta 2.

experimental autoimmune uveitis ratmodel; Qufeng Huoxue pill;TGF-beta2;uveitis

R773;R285.5

A

1002-4379（2017）03-0146-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.03.002

國家自然科學基金（81273808）湖南省科技計劃項目（2012SK3136）

1湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙410007 2湖南中醫藥大學，長沙410208

喻京生，yujingsheng-mike@163.com

Influence of Qufeng Huoxue pill on TGF-beta 2 expression in experimental autoimmune uveitis rat model

YU Jingsheng1,XIAOXia 2,LIWei2,et,al.

1.The FirstHospitalofHunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208,China;2.Hunan University ofChineseMedicine,Changsha,410208,China