祛風及開竅類引經(jīng)藥對六味地黃丸有效成分眼內(nèi)分布的影響

白昱旸，陳強，梁麗娜，李雪麗，梁潔，馬群英

·論著：實驗研究·

祛風及開竅類引經(jīng)藥對六味地黃丸有效成分眼內(nèi)分布的影響

白昱旸1,2，陳強1，梁麗娜1，李雪麗1，梁潔1，馬群英1

目的觀察祛風及開竅類引經(jīng)藥柴胡、防風及冰片對六味地黃丸有效成分在眼不同組織分布和代謝的影響，探討引經(jīng)藥是否可以增加藥物有效成分在眼部的靶向性聚集。方法將252只家兔隨機分為6組，每組42只，對照組正常飼養(yǎng)不作處理，其它組分別用蒸餾水、六味地黃丸、六味地黃丸+防風、六味地黃丸+柴胡、六味地黃丸+冰片溶液灌胃，在灌胃后0.25、0.50、0.75、1.00、2.00、4.00、8.00 h各時間點每組隨機取6只家兔，采用液質(zhì)聯(lián)用技術檢測房水、玻璃體、視網(wǎng)膜中莫諾苷和馬錢苷的含量，比較各組含量差異。結果房水中檢測發(fā)現(xiàn)莫諾苷、馬錢苷的濃度曲線變化趨勢較一致，均在灌胃后0.25~1 h達到峰值，在8 h后基本清除完全，其中六味地黃丸+冰片組的馬錢苷、莫諾苷的濃度在0.25~0.75 h均較六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組有效成分在玻璃體中的濃度均很低，馬錢苷的曲線呈波動趨勢，各個時間點各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），莫諾苷的曲線在0.25~1 h達到峰值，隨后在8 h基本清除完全，其中六味地黃丸+冰片組的莫諾苷濃度在0.25~0.75 h均較六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其它各組兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組視網(wǎng)膜內(nèi)莫諾苷和馬錢苷的濃度也偏低，其中六味地黃丸+冰片組馬錢苷和莫諾苷的濃度在0.25 h較六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其他組兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論冰片可以增加六味地黃丸有效成分在房水、玻璃體和視網(wǎng)膜的濃度，這可能是引經(jīng)藥的作用機制之一。

引經(jīng)藥；六味地黃丸；有效成分；眼；分布

內(nèi)治法是中醫(yī)眼科的重要治療手段，眼位至高，組織精細，結構復雜，在治療上藥力不易到達病所，故引經(jīng)理論在眼科受到臨床醫(yī)家廣泛重視。關于中藥引經(jīng)的原理，尤在涇在《醫(yī)學讀書》中說：“兵無向導則不達賊境，藥無引使則不通病所”，但是引經(jīng)藥的具體作用機制尤其在眼科的相關研究既往報道較少。本文通過觀察冰片、柴胡及防風對六味地黃丸有效成分在眼不同組織分布和代謝的影響，探討引經(jīng)藥是否可以增加藥物有效成分在眼部的靶向性聚集。

1 資料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級新西蘭兔252只，雌雄不論，8～10周齡，質(zhì)量1.8~2.5 kg。裂隙燈顯微鏡、檢眼鏡檢查眼前節(jié)及眼底均無異常。動物由北京市海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖廠提供，許可證號：SCXK（京）2011-0006。購入后，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗試劑和設備

莫諾苷和馬錢苷標準品均購自上海源葉生物科技有限公司，HPLC測定純度大于98%；巖白菜素對照品(內(nèi)標)，含量94.4%，購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純)和甲酸(色譜純)購自北京迪馬科技有限公司。Agilent6410 TripleQuadLC/MS/MS，1200 seriesHPLC，美國安捷倫科學技術公司生產(chǎn)；賽多利斯BT 25S天平，美國賽多利斯公司生產(chǎn)；英國STURAT樣品濃縮儀；Milli-Q Integral 3超純水儀，德國默克密理博公司。

1.3 樣品制備

采用隨機數(shù)字表法將252只新西蘭兔隨機分為正常對照組、蒸餾水、六味地黃丸、六味地黃丸+防風、六味地黃丸+柴胡、六味地黃丸+冰片組，對照組正常飼養(yǎng)不作處理，其余各組予以相應溶液灌胃，在灌胃后0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、4.0、8.0 h每一時間點每組隨機選取6只家兔，采用過量麻醉法處死家兔，迅速摘除眼球，用生理鹽水充分沖洗后，抽取房水，分離玻璃體、視網(wǎng)膜，并精密稱重，玻璃體勻漿，視網(wǎng)膜加生理鹽水0.5ml勻漿，將勻漿后的組織樣品于-80℃保存。

1.4 樣本處理

取視網(wǎng)膜、玻璃體、房水勻漿各100μL，分別加入113ng/mL巖白菜素內(nèi)標溶液20μL，渦旋混勻30s，加入3.5mL乙酸乙酯，渦旋提取4min，5000 r/min離心10min，吸取上清，40℃水浴氮氣吹干。殘渣用100μL乙腈:水（12：88V/V）復溶,5μL進樣分析。

1.5 色譜條件

色譜柱ZORBAX SB C-18，2.1×50mm，1.8μm；流動相為乙腈:水（含0.1%甲酸），等度洗脫，洗脫比例12:88（V/V）；流速0.4ml/min；柱溫35℃，進樣量5μL。

1.6 質(zhì)譜條件

Esl離子源，負離子模式，霧化壓力45 Psi，干燥氣(N2)流速為10 L/min，干燥氣溫度為300℃，毛細管電壓4000V，多離子反應監(jiān)測(MRM)方式，監(jiān)測離子m/z451.2→242.9(莫諾苷)、m/z435.2→227.2(馬錢苷)→192巖白菜素(內(nèi)標)，莫諾苷、馬錢苷和內(nèi)標碎裂電壓分別為80 V，90 V，60 V，120 V,莫諾苷、馬錢苷碰撞電壓均為10 V，內(nèi)標碰撞電壓為15 V。

1.7 統(tǒng)計學處理方法

所得數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示，采用Excel 2003及SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計處理和繪圖。不同組別重復測量資料的比較采用重復測量的方差分析進行檢驗,若不滿足球形檢驗，則使用Greenhouse-Geisser S校正系數(shù)進行校正；在各時間點上不同組別的兩兩比較采用單因素方差分析，若方差齊性，用LSD法作兩兩比較，若方差不齊，用Dummett T3法作兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 六味地黃丸有效成分在眼不同組織分布的線性方程

血漿莫諾苷、馬錢苷的檢測濃度分別在1.014、0.988 ng/mL以上與峰面積呈良好線性關系（表1）；房水莫諾苷、馬錢苷的檢測濃度分別為2.02～259 ng/mL、1.97～253 ng/mL，與峰面積呈良好線性關系；玻璃體莫諾苷、馬錢苷的檢測濃度分別為在2.02～259 ng/mL、1.97～253 ng/mL，與峰面積呈良好線性關系；視網(wǎng)膜莫諾苷、馬錢苷的檢測濃度分別為2.02～518 ng/mL、1.97～506 ng/mL，與峰面積呈良好線性關系。

表1 莫諾苷及馬錢苷在兔眼不同組織的線性方程

2.2 六味地黃丸有效成分在眼不同組織的含量

2.2.1 六味地黃丸有效成分在房水中的分布和代謝：在觀察的7個時間點，各組莫諾苷和馬錢苷含量在房水中有相應變化，兩者濃度曲線的趨勢較一致，六味地黃丸組及六味地黃丸+防風組的馬錢苷、莫諾苷濃度在灌胃后1h達到高峰，六味地黃丸+冰片組在0.25 h即達到高峰，各組的馬錢苷、莫諾苷均在8 h基本清除完全，六味地黃丸+冰片組在0.25h~0.75 h馬錢苷的含量均較六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組高，差異有統(tǒng)計學意義(F0.25=28.933，P0.25＜0.001；F0.5=3.925，P0.5=0.036；F0.75= 7.200，P0.75=0.005)，六味地黃丸+冰片組在0.25 h~ 0.75 h莫諾苷的含量均較六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組高，差異有統(tǒng)計學意義(F0.25=8.202，P0.25=0.003；F0.5=4.503，P0.5=0.025；

F0.75=3.539，P0.75=0.048)，六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。其它時間點各組比較差異無統(tǒng)計學意義（圖1）。

圖1 各組不同時間點兔房水中莫諾苷及馬錢苷的含量

2.2.2 六味地黃丸有效成分在玻璃體中的分布和代謝：各組有效成分在玻璃體中的濃度均偏低，部分時間點的濃度已低于定量下限，說明藥物有效成分到達玻璃體中的含量很少；另外，各組莫諾苷的含量呈波動趨勢，六味地黃丸組及六味地黃丸+冰片組的馬錢苷不同觀察時間點出現(xiàn)反復的濃度下降及升高，在所觀察的時間點內(nèi)各組馬錢苷含量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。莫諾苷的濃度在0.25 h到1 h達到峰值，隨后在8 h基本清除完全。其中六味地黃丸+冰片組的莫諾苷濃度在0.25~0.75 h均較六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組高，差異有統(tǒng)計學意義（F0.25=3.551，P0.25=0.048；F0.5= 14.353，P0.5＜0.001；F0.75=7.368，P0.75=0.005），六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。其它時間點各組比較差異無統(tǒng)計學意義（圖2）。

2.2.3 六味地黃丸有效成分在視網(wǎng)膜中的分布和代謝：莫諾苷、馬錢苷在視網(wǎng)膜中的濃度變化趨勢較一致，六味地黃丸+冰片組在灌胃后0.25 h莫諾苷、馬錢苷含量達到高峰，較六味地黃丸組、六味地黃丸+防風組、六味地黃丸+柴胡組含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（F馬錢苷=3.265，P馬錢苷=0.043；F莫諾苷=3.274，P莫諾苷=0.047），其它各組兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；隨后莫諾苷、馬錢苷的濃度迅速下降并趨于平緩（圖3），各組之間相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖2 各組不同時間點兔玻璃體中莫諾苷及馬錢苷的含量

圖3 各組不同時間點兔視網(wǎng)膜中莫諾苷及馬錢苷的含量

3 討論

評價藥物在眼部的療效首先應考慮該藥能否透過眼給藥屏障到達作用部位，中醫(yī)眼科許多經(jīng)典中藥方劑已經(jīng)應用于臨床多年，可能由于檢測方法的限制，口服給藥后有效成分在眼內(nèi)的濃度、血眼屏障的通過率以及如何提高通過率方面的研究鮮有報道。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術是近年來發(fā)展的藥物檢測手段，目前已廣泛應用于生物樣品的分析和藥代動力學研究，具有靈敏度高，特異性強，重現(xiàn)性好，回收率穩(wěn)定等特點[1-2]。六味地黃丸是滋補肝腎的經(jīng)典方劑，在眼科應用也較為廣泛，尤其是視網(wǎng)膜退行性病變，雖然臨床證型較為復雜，但肝腎不足是其常見證型，因此臨床上常用六味地黃丸加減治療。現(xiàn)代藥理學研究表明，莫諾苷、馬錢苷為六味地黃丸體內(nèi)代謝的主要活性成分，具有保護腦神經(jīng)的作用[3-4]。在本次實驗中我們采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術觀察六味地黃丸配伍引經(jīng)藥是否能增加莫諾苷和馬錢苷在眼部的靶向性聚集。

在眼科內(nèi)服方劑的引經(jīng)藥中，風藥是最常用的，東垣《蘭室秘藏·卷中頭痛門》曰：“高巔之上，惟風可到，故味之薄者，陰中之陽，乃自地升天者也”；《脾胃論》曰：“腎肝之病同一治，為俱在下焦，非風藥行經(jīng)不可也”。除用于治療外障眼病外，在治療內(nèi)障方中也多配伍風藥，如《太平惠民和劑局方》之明睛地黃丸中之防風，李東垣的益陰腎氣丸中的柴胡，倪維德之石解夜光丸的防風，傅仁宇之生熟地黃丸中的防風、羌活，根據(jù)中醫(yī)理論眼位至高,內(nèi)服方劑中伍用風藥，取其升散之功,使藥力直達病所而發(fā)揮治療作用[5]。冰片是常用的芳香開竅藥，單獨較少應用，常作為引經(jīng)藥以增加其它藥物的治療效果，發(fā)揮“芳香走竄,引藥上行”的作用[6]。古代冰片在眼科中主要用于治療外眼病，如目赤、流淚、翳膜、癢痛、赤爛、干澀等，亦用治目昏等內(nèi)障，分外用和內(nèi)服，以外用為主[7]。現(xiàn)代藥代動力學研究發(fā)現(xiàn)，冰片可提高家兔血眼屏障的通透性,是一種有效促進藥物透過血眼屏障的穿透促進劑[8]。

我們研究結果顯示各組有效成分在玻璃體及房水中的濃度均偏低，部分玻璃體藥物濃度已低于定量下限，說明藥物有效成分受血-視網(wǎng)膜屏障及血-房水屏障的影響，到達玻璃體和房水中的含量較少，相對來說在視網(wǎng)膜中的分布較高。給藥后各組分在家兔房水、玻璃體、視網(wǎng)膜中呈現(xiàn)相似的動態(tài)變化過程，冰片對藥物有效成分吸收的促進作用較大，給藥0.25-0.5 h后在各組織中均達最大濃度，隨后快速消除，8 h時各組分已基本清除完全，六味地黃丸+冰片組的有效成分在眼組織中含量與其它組相比差異有統(tǒng)計學意義，提示冰片具有較好的“引經(jīng)”作用。近些年學者們對冰片的引經(jīng)機制也進行了探討，葛朝莉等[9]的研究表明，冰片對大鼠腦毛細血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接影響顯著，可使大鼠血腦屏障的超微結構發(fā)生可逆性改變。劉娜[17]發(fā)現(xiàn)灌胃冰片后血腦屏障（blood brain barrier,BBB）通透性增加，6小時作用最明顯，伴隨著血腦屏障的開放增加，羥基紅花黃色素A及葛根素在腦內(nèi)的濃度亦升高。趙保勝等[10]指出用冰片誘導的BBB開放與病理性BBB開放有著質(zhì)的區(qū)別，其開放為生理性開放，不會引起腦的病理性損害。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)冰片可以一過性影響視網(wǎng)膜及脈絡膜claudin-5蛋白的表達[12]，claudin-5是血-視網(wǎng)膜屏障緊密聯(lián)接的組成蛋白，對claudin-5基因抑制的結果使得血視網(wǎng)膜屏障有選擇性、一過性及可逆性的開放，可以使分子量小于800道爾頓的藥物通過血視網(wǎng)膜屏障從而達到治療目的[13]。因此，冰片對藥物在眼部的引經(jīng)作用可能與其促使血視網(wǎng)膜屏障生理性開放有關。

本研究從藥物代謝角度初步觀察了柴胡、防風及冰片對六味地黃丸有效成分眼內(nèi)分布的影響，探討了冰片作為引經(jīng)藥的作用機制，為臨床引經(jīng)藥的應用提供了一定的客觀依據(jù)及理論基礎，關于加用冰片后能否增強六味地黃丸對視網(wǎng)膜變性病理模型的保護作用需要從藥效學角度進一步觀察和研究。

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Effectofw ind-expelling and orifice-openingmeridian-lead-in herbson intraocular distribution ofactive ingredients from Liuwei Dihuang Pills.

BAIYuyang,CHEN Qiang,LIANG Lina,et al.
Eye Hospital,China Academy ofChineseMedicalSciences,Beijing100040,China

OBJECTIVE Toobserve the effectofwind-expellingand orifice-openingmeridian-lead-in drugon the intraocular distribution of active ingredients from Liuwei Dihuang pills,and to investigate whether meridian-lead-in drugs could increase the targeting accumulation of active ingredients in the eye.METHODSA total of 240 rabbitswererandomly divided into6 groupsevenly.Subjects in controlgroup were fed routinelywithoutany treatment,the othergroupswere administrated with distilled water,LiuweiDihuang pills,LiuweiDihuang pillsplus Bingpian,LiuweiDihuang pillsplus Fangfeng,LiuweiDihuang pillsplus Chaihu respectively by gavage.At time pointas 0.25h,0.5h,0.75h,1.0h,2.0h,4.0h,8.0h after gavage,6 rabbits randomly chosen from each group were tested for their content of Morroniside and Loganinin aqueous humor,vitreous and retina by LC-MS,and the difference between groupswas compared aswell.RESULTS In the aqueoushumor,the contentofMorroniside and Loganin shared similar trend,both reached peak at 0.25 to 1h after gavage, and were both dispelled totally 8hours after gavage.A-mong them,the contents of Morroniside and Loganin in LiuweiDihuang pills plus Bingpian at the time pointsbetween 0.25h~0.75 h were significantly higher than thatof Liuwei Dihuang pills group,Liuwei Dihuang pills plusFangfeng group,Liuwei Dihuang pills plus Chaihu group（P<0.05）.The contents of all groupswere in low level in vitreous.Loganin content varied and showed no significant difference among all the groups(P>0.05).Morroniside reached peak between 0.25 and 1h after gavage,and then was dispelled totally at 8th post gavage.The contents of Morroniside in LiuweiDihuang pills plus Bingpian group at the time points between 0.25h and 0.75h were significantly higher than that of Liuwei Dihuang pills group,Liuwei Dihuang pills plus Fangfeng group,Liuwei Dihuang pillsplusChaihu group（P<0.05）.Therewasno significantdifferencebetween other two groups in pair（P>0.05）.The contentofMorroniside and Loganin in the retinawasalso low in all groups.Among them,the content in LiuweiDihuang pills plus Bingpian group 0.25h after gavagewas significantly higher than thatof LiuweiDihuang pills group, LiuweiDihuang pills plus Fangfeng group,LiuweiDihuang pills plus Chaihu group（P<0.05）.Therewasno significantdifference in comparisonsbetween other two groups（P>0.05）.CONCLUSIONS Bingpian could increase the active ingredients of Liuwei Dihuang pills in the aqueous humor,vitreous,and retina,which might be one of the mechanismsofmeridian-lead-in drug.

meridian-lead-in drug;LiuweiDihuang pills;active ingredient;eye;distribution

R285.5；R77

A

1002-4379（2017）03-0141-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.03.001

1國家自然科學基金（81102618）

2人力資源和社會保障部“留學人員科技活動項目”作者單位：1中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院，北京100040；

2廣東省中醫(yī)院眼科，廣州510120

梁麗娜，Email:lianglina2001@hotmail.com