競爭性ELISA檢測魚糜制品中蛋清含量

趙勇娟，翁 凌,2，顏龍杰，劉孟琦，張凌晶,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361021）

競爭性ELISA檢測魚糜制品中蛋清含量

趙勇娟1，翁 凌1,2，顏龍杰1，劉孟琦1，張凌晶1,2，曹敏杰1,2,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361021）

通過純化蛋清中主要成分卵清蛋白（ovalbumin，OVA），制備抗OVA多克隆抗體，利用制備的抗體建立魚糜制品中蛋清定量檢測的競爭性酶聯免疫吸附測定方法（competitive enzyme linked-immunosorbent assay，c-ELISA）。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳和Western blot結果顯示，制備的抗OVA多克隆抗體特異性良好。以熱處理的OVA為競爭抗原建立的c-ELISA法檢測限為1.82 mg/kg，組內變異系數為3.1%，組間變異系數為7.8%，回收率為87.4%～97.2%，表明建立的方法重復性好，準確性較高。利用建立的方法對6 種商品化的魚糜制品進行檢測，發現其蛋清的添加量在2.7～83.5 g/kg之間。本研究為今后魚糜制品中蛋清含量規范標識的監管提供了重要的技術支持。

蛋清；卵清蛋白；魚糜制品；競爭性酶聯免疫吸附測定方法

我國是水產品生產和加工大國，2014年水產品總產量達到6 462萬 t，水產品加工產量為2 053萬 t，其中，魚糜制品產量達到152萬 t[1]。隨著魚糜制品產量的增加及魚漿原料價格的上漲，更多的低值魚類被用于魚漿制備。為了提高魚糜制品的口感，在實際生產過程中，部分企業通過過量添加包括蛋清在內的非魚肉蛋白成分，以達到降低生產成本并提高制品彈性的效果。食品法典委員會已經宣布，要求在“一般標準預包裝食品標簽的”8類食物過敏，包括雞蛋[2]。但該類非魚肉蛋白的添加卻沒有明確標識，損害了消費者的利益。作為八大類致敏食物之一，雞蛋過敏原主要存在于蛋清中，包括卵鐵傳遞蛋白、卵類黏蛋白、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）以及溶菌酶等，其中卵類黏蛋白是最主要的過敏原，而OVA含量最高，約占蛋清總蛋白的54%[3-4]，這些過敏原經熱處理后仍具有致敏性[5-6]。據報道，7歲以下兒童對雞蛋過敏率較高[7]，尤其是嬰幼兒，約有0.5%～2%對雞蛋過敏，臨床表現為皮炎、哮喘、過敏性休克，甚至死亡[8]。痕量過敏原即可引發過敏癥狀的發生，因此，對食物中含有的蛋清成分進行檢測對于食品安全控制也十分必要。目前，有報道一些應用于紅酒中蛋清成分檢測的方法，如Tolin等[9]采用液相色譜-質譜聯用技術對紅酒中蛋清成分進行檢測，檢測限為5 g/L蛋清添加量；Pilolli等[10]采用表面等離子共振技術以OVA為靶蛋白對紅酒中的蛋清組分進行檢測，靈敏度顯著提高至0.03～0.2 μg/mL。Mattarozzi等[11]采用液相色譜-電噴霧電離串聯質譜檢測紅酒中的OVA，其線性范圍為10～800 ng/mL。另外，由于多數流感疫苗采用雞胚進行生產，因此，對于流感疫苗中OVA的監測也受到廣泛關注，主要采用酶聯免疫吸附測定方法（enzyme linked-immunosorbent assay，ELISA）[12-13]進行定量檢測。大多數食物都經過各種條件加工，如烘烤和蒸煮，這些處理條件可以改變溶解度，蛋白的結構與生物活性[14]。特別是魚糜制品制備過程的特殊加工工藝，使最終產品中的蛋白組分因交聯等發生了變化，更加大了檢測難度。目前為止，仍未有相關方法應用于魚糜制品中蛋清定量檢測的報道。

在蛋清蛋白組分中，OVA含量豐富[15]，且具有良好的熱穩定性[16]。因此，本研究以OVA為標志蛋白，制備相應的多克隆抗體，建立可靠的魚糜制品中蛋清的定量檢測方法，以期為今后規范魚糜制品中蛋清的正確標識提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

爆汁小魚丸、閩南脆丸、魚豆腐及雞蛋 廈門市集美區新華都超市。

DEAE-Sepharose樹脂、Protein A Sepharose樹脂美國GE Healthcare公司；蛋白質分子質量標準 立陶宛Fermentas公司；其他試劑為國產分析純產品。

1.2 儀器與設備

Avanti JA-25高速冷凍離心機 美國Beckman公司；Biologic LP蛋白質柱層析系統 美國Bio-Rad公司；熒光化學發光凝膠成像儀 法國Alpha Innotech公司；PT-2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；G:BOX凝膠成像儀 英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 OVA的純化

OVA的純化主要參考Tankrathok等[17]的方法并加以修改。將35 g蛋清于4 倍體積20 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.5）中攪拌3 h，離心取上清液上樣于用20 mmol/L的Tris-HCl（pH 7.5）預平衡的DEAE-Sepharose離子層析柱。用平衡緩沖液流洗后，用含有0～0.1 mol/L NaCl的 20 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.5）進行洗脫，收集第1個洗脫峰即為純化的目的蛋白。

1.3.2 OVA的鑒定

將純化的目的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，經考染切膠回收蛋白條帶，送至上海中科新生命生物科技有限公司進行肽質量指紋圖譜分析。

1.3.3 抗OVA多克隆抗體的制備

將純化的OVA經95 ℃處理15 min，取150 μg與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，進行皮下肌肉注射新西蘭雄兔，每隔2 周以相同劑量的抗原加強免疫。免疫4 次后，采血，靜置，待血清析出后，2 000×g離心10 min，將上清液與1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液混合，上樣于用0.1 mol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）預平衡的Protein G Sepharose親和層析柱進行抗OVA多克隆抗體的純化。

1.3.4 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[18]的方法，采用質量分數12%的膠進行分析，即先將制備的樣品與上樣緩沖液混合，95 ℃加熱10 min后，進行電泳。電泳結束后，用考馬斯亮藍染色，經脫色液（甲醇-乙酸-水（3∶1∶6，V/V））脫色至條帶清晰后，用凝膠成像儀記錄結果。

1.3.5 Western blot分析

參照Towbin等[19]的方法進行，蛋白經SDS-PAGE分離后，轉移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶封閉1.5 h，以抗OVA多克隆抗體為一抗，室溫孵育1.5 h后用含150 mmol/L和0.5%吐溫20的10 mmol/L Tris-HCl（TBST），pH 7.4洗5 次，再用抗兔IgG為二抗孵育1 h后用TBST洗5 次，采用增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，在化學發光凝膠成像系統上記錄結果。

1.3.6 熱處理OVA的制備

將純化的OVA蛋白分別置于70、80、90、95 ℃水浴鍋孵育15 min后，立即置于冰上冷卻。采用SDS-PAGE和競爭性ELISA（competitive-ELISA，c-ELISA）分析加熱對OVA穩定性和免疫活性的影響。

1.3.7 c-ELISA法的建立及有效性驗證

c-ELISA的建立參考Crowther[20]的方法進行。采用棋盤法對包被抗原、一抗及二抗的工作濃度進行優化。以優化的抗原濃度進行包被，以5%脫脂奶封閉后，加入適當稀釋的樣品和等體積的一抗，于37 ℃孵育1.5 h，洗滌后用二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后加入3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺在37 ℃顯色20 min，加入H2SO4終止反應，測定在450 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。

標準曲線的建立是以4 倍稀釋法制備不同質量濃度95 ℃熱處理后的OVA做為競爭性抗原，進行c-ELISA測定。將各質量濃度競爭性OVA的OD值換算成B/B0（B為各質量濃度競爭性OVA在450 nm波長處的OD值，B0為空白對照的平均值）。利用OriginPro 9.1.0軟件進行標準曲線的擬合及數據分析。

方法的重復性以組內誤差和組間誤差進行評價。組內誤差以同一組內14 個重復樣品的平均變異系數進行計算；組間誤差以連續3 d、每天3 個重復樣品的平均變異系數進行計算[21]。檢測靈敏度根據公式靈敏度=B0-3s[22]計算，其中B0為24 個空白對照的平均值，s為這24 個空白對照的標準偏差。

1.3.8 魚丸及魚糜制品檢測樣品的制備

魚丸的制備參考Jiang Taoling等[23]的方法進行。取鰱魚肉，用冰水洗凈，用冰水漂洗魚肉2 次，將魚肉3 000×g離心5 min脫水，絞肉后空擂10～15 min后，加入3%食鹽進行鹽潰20～30 min。充分擂潰后，分別制成含1、10、100 g/kg蛋清的魚丸，手工成型后，在90～95 ℃水煮定型，待魚丸浮起后立即撈出冷卻。

檢測樣品的制備方法為取100 g魚丸或商品化魚糜制品，充分剁碎后，從中取出20 g樣品，加入5 倍體積含0.1 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）的8 mol/L尿素緩沖液，組織搗碎后，4 000×g離心15 min，所得上清液經95 ℃熱處理15 min后離心取上清液即為待檢樣品。

2 結果與分析

2.1 抗OVA多克隆抗體的制備

圖1 OVA的DEAE-Sepharose離子交換柱層析圖Fig. 1 DEAE-Sepharose chromatography of OVA from egg white

通過攪拌、離心結合DEAE-Sepharose離子柱層析技術從蛋清中純化得到OVA。圖1顯示攪拌、離心后的樣品上樣于DEAE-Sepharose，經流洗、洗脫后各收集部分的情況?？梢钥闯?，OVA處于吸附部分，在約0.02 mol/L NaCl濃度開始洗脫下來。經SDS-PAGE分析（圖1內嵌圖），其分子質量約為45 ku，與Huntington等[24]報道的結果一致。電泳結果顯示為單一條帶，表明獲得高純度OVA。為進一步確定純化的蛋白為OVA，將純化的樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司，利用肽質量指紋圖譜技術對其進行鑒定分析。圖2為獲得的目的蛋白的其中一個二級質譜圖。如表1所示，共獲得11 個肽段包含150 個氨基酸殘基，與已報道的雞（Gallus gallus）OVA（gi|28566340）的氨基酸序列相似性達到100%，證實純化的蛋白為OVA。

圖2 OVA的肽質量指紋圖譜Fig. 2 Peptide mass fingerprinting of OVA from egg white

表1 與Gallus gallus OVA比對的肽段Table 1 Peptide sequences matched to the tryptic peptide mass fingerprint of ovalbumin (Gallus gallus)

2.2 抗OVA多克隆抗體的特異性分析

將純化的OVA加熱處理后，免疫新西蘭雄兔，獲得抗OVA多克隆抗體?？贵w經Protein A Sepharose親和層析柱純化后，采用Western blot進行特異性分析，結果如圖3所示。圖3A泳道2含蛋清的魚丸粗提液中除了45 ku的OVA，還含有許多其他蛋白組分，但只有分子質量為45 ku的OVA與制備的抗OVA多克隆抗體發生反應（圖3B，泳道2），未出現非特異性條帶。不含蛋清的魚丸粗提液樣品（圖3，泳道1）以及牛血清白蛋白陰性對照樣（圖3，泳道4）均不與抗體發生反應，表明制備的抗OVA多克隆抗體特異性良好，可用于后續檢測方法的建立。

圖3 抗OVA多克隆抗體的特異性分析Fig. 3 Specificity analysis of the anti-OVA polyclonal antibody

2.3 熱處理對OVA穩定性的影響

圖4 熱處理對競爭性抗原IgG結合能力的影響Fig. 4 Effect of heat treatment on the IgG-binding ability of OVA

在預實驗過程中，采用未經熱處理的OVA作為競爭性抗原進行c-ELISA，發現游離OVA的IgG結合能力相對于固相OVA幾乎沒有競爭力。因此，本研究對純化的OVA進行了70～95 ℃不同溫度處理后，通過c-ELISA法分析熱處理對OVA IgG結合能力的影響。研究結果顯示，加熱不影響OVA的溶解性，且固相抗原的IgG結合能力幾乎不受熱處理的影響。以250 ng每孔包被未熱處理或熱處理的OVA進行間接ELISA分析，最終OD450nm值均為1.5左右，沒有顯著差異。但在進行c-ELISA方法建立時，熱處理對OVA的IgG競爭性結合能力有顯著影響。如圖4所示，在抗原包被量一致的情況下，隨著加熱溫度的提高，OVA的IgG競爭性結合能力顯著上升，這與張銀等[25]的報道存在差異，這可能與所用的檢測抗體性質不同有關。本研究制備的抗OVA多克隆抗體目的是應用于魚糜制品的檢測，在魚糜制品制備過程中有加熱處理工藝，是為了更準確實現對OVA的檢測。本研究以高溫處理的OVA進行動物免疫，制備的抗體均能實現對未熱處理或熱處理OVA的特異檢測。進一步采用SDS-PAGE對OVA的熱穩定性進行驗證。由圖5可知，OVA的熱穩定性良好，95 ℃處理15 min也不發生降解，但當加熱溫度高于80 ℃時，有少量多聚體產生，這可能與熱處理導致OVA的二級結構發生改變有關[26]。Azarnia等[27]采用高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法及ELISA對意大利面中的OVA進行檢測，結果表明，食物基質及熱處理對檢測靈敏度及回收率影響較大。結合圖4的結果表明，本研究在建立c-ELISA法時，以95 ℃處理的OVA作為競爭性抗原有利于提高檢測的靈敏度。

圖5 熱處理對OVA穩定性的影響Fig. 5 Effect of heat treatment on the stability of OVA

2.4 c-ELISA法的建立

圖6 c-ELISA檢測OVA的標準曲線Fig. 6 The standard curve of quantification of OVA by c-ELISA method

采用純化的OVA抗原及制備的抗OVA多克隆抗體建立了定量檢測魚糜制品中蛋清的c-ELISA方法。經過棋盤法優化，以95 ℃、15 min處理的OVA為抗原，以100 ng/孔進行包被。以95 ℃、15 min處理的OVA為標準蛋白，0.032 mg/mL為起始質量濃度，以4 倍法稀釋，最終建立的標準曲線如圖6所示，相關系數R2=0.998，檢測靈敏度即檢測限為36.4 ng/mL。若考慮到樣品的最低稀釋倍數為10，則檢測限對應為1.82 mg/kg食物，高于Monaci等[28]采用高分辨質譜法建立的白酒中OVA等多種過敏原的檢測方法。

已有研究[15]表明，蛋清中蛋白約占總質量的11%，OVA占蛋清總蛋白的54%左右，因此，在本方法以OVA為檢測目標對魚糜制品中蛋清含量進行定量檢測時，應乘以系數16.8。

2.5 c-ELISA法的驗證

通過計算同一96 孔板上的14 個重復樣的變異系數，以及連續3 d、每天3 個重復樣的變異系數分析得到，建立的c-ELISA法的組內變異系數（n=14）為3.1%，組間變異系數（n=9）為7.8%。以自制的蛋清含量分別為1、10、100 g/kg的魚丸進行c-ELISA法回收率分析。由于熱處理及食物基質可能影響到檢測準確性[29]，本研究采用含0.1 mmol/L DTT的8 mol/L尿素緩沖液[30]進行樣品制備，結果如表2所示，回收率為87.4%～97.2%，說明本研究建立的方法重復性好、準確度較高、樣品制備方法適宜，可用于魚糜制品中蛋清含量的檢測。

表2 c-ELISA檢測魚丸中蛋清的回收率分析Table 3 Recovery of egg white added to fish meatballs by c-ELIS A

2.6 c-ELISA法的應用

圖7 商品化魚糜制品中蛋清的含量Fig. 7 Added egg white content in commercial surimi products

利用建立的方法對市售6 組魚糜制品進行檢測，6 組魚糜制品分別為來自A公司的爆汁小魚丸、閩南脆丸、魚豆腐和B公司的爆汁小魚丸、閩南脆丸、魚豆腐。從圖7可以看出，不同魚糜制品中，蛋清的添加量差異很大，在2.7～83.5 g/kg之間。即使是同一魚糜制品，不同公司產品的含量差異明顯，表明各公司類似產品的配方存在較大差異，這也提示了在魚糜制品包裝上對蛋清含量進行明確標示及監管的必要性。

3 結 論

本研究以蛋清蛋白組分中熱穩定性好、含量豐富的OVA為目標蛋白，制備抗OVA多克隆抗體，成功建立了魚糜制品中蛋清含量檢測的c-ELISA法。該方法檢測限為1.82 mg/kg食物，組內變異系數為3.1%，組間變異系數為7.8%，回收率為87.4%～97.2%，具有良好的重復性和準確性，并成功應用于對市售魚糜制品中蛋清含量的檢測。本研究可為今后魚糜制品中蛋清的快速檢測及規范標識的監管提供重要的技術參考。

[1] 農業部漁業局. 中國漁業年鑒[M]. 北京: 中國農業出版社, 2015: 212-259.

[2] COWBURN G, STOCKLEY L. Consumer understanding and use of nutrition labelling: a systematic review[J]. Public Health Nutrition, 2005, 8(1): 21-28.

[3] POULSEN L K, HANSEN T K, NORGAARD A, et al. Allergens from fish and egg[J]. Allergy, 2001, 56(S67): 39-42. DOI:10.1034/ j.1398-9995.2001.00912.x.

[4] DHANAPALA P, SILVA C D, DORAN T, et al. Cracking the egg: an insight into egg hypersensitivity[J]. Molecular Immunology, 2015, 66(2): 375-383. DOI:10.1016/j.molimm.2015.04.016.

[5] TONG P, GAO J Y, CHEN H B, et al. Effect of heat treatment on the potential allergenicity and conformational structure of egg allergen ovotransferrin[J]. Food Chemistry, 2013, 131(2): 603-610. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.08.084.

[6] MA X J, CHEN H B, GAO J Y, et al. Conformation affects the potential allergenicity of ovalbumin after heating and glycation[J]. Food Additives and Contaminants Part A-Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assessment, 2013, 30(10): 1684-1692. DOI:10.1080 /19440049.2013.822105.

[7] CHANG M L, SHAO B, LIU Y H, et al. Analysis of allergens in 5473 patients with allergic diseases in Harbin, China[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2013, 26(11): 886-893.

[8] DHANAPALA P, SILVA C D, DORAN T, et al. The prevalence of food allergy[J]. Molecular Immunology, 2015, 66(2): 375-383. DOI:10.1016/j.molimm.2015.04.016.

[9] TOLIN S, PASINI G, CURIONI A, et al. Mass spectrometry detection of egg proteins in red wines treated with egg white[J]. Food Control, 2012, 23(1): 87-94. DOI:10.1016/j.foodcont.2011.06.016.

[10] PILOLLI R, VISCONTI A, MONACI L. Rapid and label-free detection of egg allergen traces in wines by surface Plasmon resonance biosensor[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(13): 3787-3797. DOI:10.1007/s00216-015-8607-4.

[11] MATTAROZZI M, MILIOLI M, BIGNARDI C, et al. Investigation of different sample pre-treatment routes for liquid chromatographytandem mass spectrometry detection of caseins and ovalbumin in fortified red wine[J]. Food Control, 2014, 38(1): 82-87.

[12] 田博, 施彤, 王晉, 等. 酶聯法檢測流感疫苗中卵清蛋白含量試劑盒的質量驗證[J]. 中國生物制品學雜志, 2006, 19(6): 647-652. DOI:10.13200/j.cjb.2006.06.100.tianb.032.

[13] LI J T, RANK M A, SQUILLACE D L, et al. Ovalbumin content of influenza vaccines[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, 125(6): 1412-1413. DOI:10.1016/j.jaci.2010.03.009.

[14] FU T J, MAKS N, BANASZEWSKI K. Effect of heat treatment on the quantitative detection of egg protein residues by commercial enzymelinked immunosorbent assay test kits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(8): 4831-4838.

[15] ABEYRATHNE E D, LEE H Y, AHN D U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pahrmaceutical agents: a review[J]. Poultry Science, 2013, 92(12): 3292-3299. DOI:10.3382/ps.2013-03391.

[16] BLOOM K A, HUANG F R, BENCHARITIWONG R, et al. Effect of heat treatment on milk and egg proteins allergenicity[J]. Pediatric Allergy and Immunology Official Publication of the European Society of Pediatric Allergy and Immunology, 2014, 25(8): 740-746.

[17] TANKRATHOK A, DADUANG S, PATRAMANON R, et al. Purification process for the preparation and characterizations of hen egg white ovalbumin, lysozyme, ovotransferrin, and ovomucoid[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2009, 39(4): 380-399. DOI:10.1080/10826060903209646.

[18] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685. DOI:10.1038/227680a0.

[19] TOWBIN H, STAEHELIN T, GORDON J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1979, 76(9): 4350-4354. DOI:10.1073/pnas.76.9.4350.

[20] CROWTHER J R. The ELISA Guidebook[M]. Totowa, NJ: Humana Press Inc, 2001: 83-112.

[21] CAI Q F, WANG X C, LIU G M, et al. Development of a monoclonal antibody-based competitive enzyme linked-immunosorbent assay (c-ELISA) for quantification of silver carp parvalbumin[J]. Food Control, 2013, 29(1): 241-247. DOI:10.1016/j.foodcont.2012.06.016.

[22] HUSAIN F T, BRETBACHER I E, NEMES A, et al. Development and validation of an indirect competitive enzyme linked-immunosorbent assay for the determination of potentially allergenic sesame (Sesamum indicum) in food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(3): 1434-1441. DOI:10.1021/jf903350h.

[23] JIANG T L, CAI Q F, SHEN J D, et al. Establishment of immunological methods for the detection of soybean proteins in surimi products[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 64(1): 344-349. DOI:10.1016/j.lwt.2015.06.005.

[24] HUNTINGTON J A, STEIN P E. Structure and properties of ovalbumin[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 2001, 756(1/2): 189-198. DOI:10.1016/S0378-4347(01)00108-6.

[25] 張銀, 佟平, 麻小娟, 等. 熱加工及超高壓處理對卵白蛋白抗原性的影響[J]. 食品科學, 2010, 31(19): 250-253.

[26] GOLIAS J, SCHWARZER M, WALLNER M, et al. Heat-induced structural changes affect OVA-antigen processing and reduce allergic response in mouse model of food allergy[J]. PloS ONE, 2012, 7(5): e37156. DOI:10.1371/journal.pone.0037156.

[27] AZARNIA S, BOyE J I, MONGEON V, et al. Detection of ovalbumin in egg white, whole egg and incurred pasta using LC-ESI-MS/MS and ELISA[J]. Food Research International, 2013, 52(2): 526-534. DOI:10.1016/j.foodres.2013.02.039.

[28] MONACI L, LOSITO I, de ANGELIS E, et al. Multi-allergen quantification of fining-related egg and milk proteins in white by highresolution mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2013, 27(17): 2009-2018. DOI:10.1002/rcm.6662.

[29] AZAMIA S, BOyE J I, MONGEON V, et al. Detection of ovalbumin in egg white, whole egg and incurred pasta using LC-ESI-MS/MS and ELISA[J]. Food Research International, 2013, 52(1): 526-534. DOI:10.1016/j.foodres.2013.02.039.

[30] 江韜玲, 沈建東, 蔡秋鳳, 等. 熒光法檢測魚糜制品中大豆蛋白的研究[J]. 食品工業科技, 2013, 34(14): 54-62. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2013.14.043.

Quantification of Added Egg White in Surimi Products by Competitive Enzyme Linked-Immunosorbent Assay

ZHAO Yongjuan1, WENG Ling1,2, YAN Longjie1, LIU Mengqi1, ZHANG Lingjing1,2, CAO Minjie1,2,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. National & Local Joint Engineering Research Center of Deep Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China)

In this study, a competitive enzyme linked-immunosorbent assay (c-ELISA) using the polyclonal antibody against purified ovalbumin (OVA), the major protein in egg white, was proposed to quantify added egg white in surimi products. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot results showed the high specificity of the anti-OVA polyclonal antibody. The limit of detection (LOD) of the c-ELISA method was 1.82 mg/kg, and the intra- and inter-assay coefficients of variation were 3.1% and 7.8%, respectively. Recovery rates of egg white added to fish meatballs ranged from 87.4% to 97.2%. The c-ELISA method was successfully applied to quantify added egg white in commercial surimi products, and results demonstrated that the added egg white content was 2.7–83.5 g/kg in six samples from different manufacturers. Our results indicated that the method established can be applied to quantify added egg white in surimi products.

egg white; ovalbumin; surimi products; competitive enzyme linked-immunosorbent assay (c-ELISA)

10.7506/spkx1002-6630-201714044

TS254

A

1002-6630（2017）14-0284-06

趙勇娟, 翁凌, 顏龍杰, 等. 競爭性ELISA檢測魚糜制品中蛋清含量[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 284-289.

10.7506/ spkx1002-6630-201714044. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yongjuan, WENG Ling, YAN Longjie, et al. Quantification of added egg white in surimi products by competitive enzyme linked-immunosorbent assay[J]. Food Science, 2017, 38(14): 284-289. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714044. http://www.spkx.net.cn

2016-08-09

國家自然科學基金青年科學基金項目（31271838）；福建省重大科研專項（2011NZ0002-1）

趙勇娟（1988—），女，碩士研究生，研究方向為水產品加工。E-mail：1217248231@qq.com

*通信作者：曹敏杰（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產品深加工、蛋白質化學。E-mail：mjcao@jmu.edu.cn