植物乳桿菌發酵對豆粕蛋白結構的影響

張莉麗，崔 憲，張功圣，姜 帆，劉容旭，韓建春,3,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農業大學工學院，北京 100083；3.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物乳桿菌發酵對豆粕蛋白結構的影響

張莉麗1，崔 憲2，張功圣1，姜 帆1，劉容旭1，韓建春1,3,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農業大學工學院，北京 100083；3.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

利用植物乳桿菌發酵降解低溫豆粕乳，研究其中大豆蛋白結構的變化。隨發酵時間的延長，樣品水解度和體外消化率均呈升高趨勢，可溶性蛋白粒徑分布向低粒徑方向移動，說明脫脂豆粕中大豆蛋白經發酵后有一定程度的降解。同時，發酵處理后提取的大豆蛋白與原始大豆蛋白和發酵0 h時提取的大豆蛋白相比，蛋白分子進一步展開，β-折疊含量升高，α-螺旋含量降低，熒光光譜中最大吸收波長發生紅移，暴露巰基含量升高。另外，掃描電子顯微鏡觀察結果表明大豆蛋白經發酵后表面不再光滑，出現腐蝕性孔洞。

植物乳桿菌；豆粕；蛋白結構；發酵

大豆是我國四大油料作物之一，低溫脫脂豆粕是油脂加工中的副產物，富含大量蛋白質，其必需氨基酸含量十分接近聯合國糧農組織/世界衛生組織推薦的比例，是十分優良的植物性蛋白質之一，同時不含膽固醇，易于消化，這一點優于動物性蛋白，因此被廣泛應用于食品產業中。但在提取油脂和制備脫脂豆粕后，通過傳統工藝提取大豆蛋白會造成大豆蛋白的部分變性，導致功能性質的降低[1]。要想得到具有良好功能特性的大豆蛋白，需對其改性。

大部分改性方法是將大豆蛋白提取制備后，通過物理法、化學法和酶法對蛋白質結構進行改性或修飾，以達到改善其功能性質的目的[2-4]，但這些方法目前或多或少存在一些問題，例如化學試劑殘留、安全性降低、生產成本高、改性效果不明顯、產生不良風味、原料利用率低等問題[5]。

前期研究發現，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）具有良好的發酵大豆乳的能力[6]，并且通過其發酵可以改善豆粕蛋白的功能特性[7]。對于某些人來說，大豆球蛋白是重要的過敏源[8]。乳桿菌發酵可以分解大豆球蛋白從而降低其過敏性[9-10]。因此利用乳桿菌發酵大豆蛋白將是未來的一個研究熱點。目前，雖然有一些關于發酵提高大豆蛋白營養價值的研究[11]，但是鮮有關于乳酸菌發酵對其結構影響的相關報道。

本研究以脫脂豆粕為原料，通過L. plantarum液態發酵一定時間后，利用傳統的堿溶酸沉法提取大豆蛋白后，測定其結構變化，研究L. plantarum發酵過程中大豆蛋白結構改變情況，為改善大豆蛋白功能性質提供新方法和一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

L. plantarum KLD1.0391，東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室保存。

液體MRS培養基用于菌種活化。

大豆乳培養基（豆與蒸餾水比例為1∶10（g/mL），磨成豆漿）：用于菌種活化和發酵劑制備[12]。

1.2 儀器與設備

PB-10型精密酸度計 德國賽多利斯公司；Ultrospec 1100 pro型紫外-可見分光光度計 美國通用電氣公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；F-4500熒光分光光度計、J-815CD Spectrometer圓二色光譜儀 日本Jasco公司；S-3400N掃描式電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Zetasizer Nano粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白工藝流程

脫脂豆粕→粉碎研磨→過篩（100 目標準篩）→豆粕乳（按1∶12的固液比與水混合）→殺菌（95 ℃，10 min）→冷卻→接入種子發酵劑→發酵至0、3、6、9、12 h→堿溶酸沉提取蛋白→透析除鹽→冷凍干燥→大豆蛋白樣品

1.3.2 水解度測定

采用王波等[13]的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法，略有改動。將一定量經發酵前后提取的大豆蛋白樣品，添加15% TCA溶液定容至10 mL，混合振蕩，靜置10 min后，4 000×g離心15 min，取上清液，樣品總氮和上清液中可溶性氮含量采用凱氏定氮法[14]測定。水解度根據公式（1）計算。

式中：N1為原始大豆蛋白溶液（添加15%TCA）中可溶性氮含量/（g/100 mL）；N2為原始大豆蛋白中總氮含量/（g/100 mL）；N3為經發酵后提取的大豆蛋白溶液（添加15% TCA）中可溶性氮含量/（g/100 mL）。

1.3.3 體外消化率測定

稱量200 mg大豆蛋白樣品，置于錐形瓶中，添加15 mL 0.1 mol/L HCl溶液（含1.5 mg胃蛋白酶）。將錐形瓶在37 ℃條件下水浴3 h后，添加3.3 mL 0.5 mol/L NaOH溶液和7.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 8.0，含4 mg胰酶），將混合液在37 ℃條件下水浴24 h后，添加10 mL 10% TCA終止反應，在室溫下5 000×g離心20 min，得到上清液，通過凱氏定氮法測定上清液和樣品中的含氮量。蛋白質體外消化率按公式（2）計算。

1.3.4 粒徑分布測定

將大豆蛋白樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），室溫下攪拌2 h，離心去除沉淀，上清液在4 ℃存放過夜以確保蛋白完全溶解，Lowry法[15]測定蛋白質量濃度，稀釋成1 mg/mL蛋白質溶液，采用Zetasizer Nano粒度分布儀在25 ℃測定蛋白質樣品中可溶性蛋白的粒徑分布[16]。

1.3.5 暴露巰基含量的測定

參照Beveridge等[17]的方法測定。

1.3.6 圓二色譜測定

本研究利用圓二色譜譜在遠紫外區（260～180 nm）測定蛋白質二級結構[18]。空白為去離子水，所得數據用摩爾橢圓率表示。數據由Jasco公司提供的Yang’s程序來分析大豆蛋白的二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲所占的比率。

1.3.7 熒光光譜的測定

參考Bonomi[19]的測定方法。

1.3.8 掃描電子顯微鏡的測定

樣品處理參照Ghosh等[20]的方法，樣品的微觀結構使用掃描電子顯微鏡進行觀測，加速電壓為5 kV。樣品在觀察前用離子噴射器在大豆分離蛋白粉表面噴15 nm的金箔[21]。

2 結果與分析

2.1 發酵對豆粕蛋白的水解度和體外消化率的影響

在前期研究中發現發酵12 h后L. plantarum生長逐步進入生長平穩期，pH值下降緩慢，所產蛋白酶活力下降，所以在發酵0、3、6、9、12 h提取的大豆蛋白作為實驗樣品，以原始大豆蛋白為對照組，比較蛋白水解度、體外消化率的變化。研究在L. plantarum發酵過程中大豆蛋白降解的變化情況。

圖 1L. plantarum發酵對大豆蛋白水解度和體外消化率的影響Fig. 1 Effect of L. plantarum fermentation on in vitro digestibility and DH of soybean proteins

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，大豆蛋白水解程度呈現發酵前期增加快速后期緩慢的趨勢，這可能是隨著發酵時間延長，發酵底物不斷被消耗，質量濃度降低，所產蛋白酶也逐漸失活，乳酸菌產生的代謝物與酶以復合體形式存在，抑制蛋白酶的活力，所以發酵后期大豆蛋白水解程度緩慢增加，發酵12 h時提取的大豆蛋白水解度達到6.25%。這些結果表明L. plantarum所產蛋白酶、肽酶對大豆蛋白有一定降解作用，這與Aguirre等[22]的研究結果一致。隨著發酵時間的延長，經發酵后提取的大豆蛋白體外消化率逐漸升高，主要是因為發酵后，蛋白質多降解為多肽、小肽及游離氨基酸等，這與劉海燕[23]研究結果一致。另外，王乃富[24]在研究中也得到類似結果，其利用乳酸菌發酵大豆粉時發現大分子蛋白質發生降解。

2.2 發酵對可溶性大豆蛋白粒徑分布的影響

本研究通過測定發酵前后可溶性大豆蛋白的粒徑分布變化，以原始可溶性大豆蛋白作為對照組，研究L. plantarum對大豆蛋白降解作用的影響，結果如圖2和表1所示。

由圖2可知，所有樣品的粒徑分布均呈雙峰分布，與原始可溶性大豆蛋白相比較，發酵0 h時提取的可溶性大豆蛋白的粒徑主要分布區域向高粒徑方向移動，是由于滅菌熱處理導致大豆蛋白發生部分聚集，產生一些可溶性聚集體[25]，但是平均粒子直徑并無明顯改變。原始可溶性大豆蛋白的雙峰主要分布在10～100 nm和100～1 000 nm處，經過發酵后提取的可溶性大豆蛋白的雙峰主要分布在1～10 nm和10～100 nm處，表明經過發酵后提取的大豆蛋白的粒徑主要分布區域逐漸向低粒徑方向移動。

圖2 發酵前后可溶性大豆蛋白的粒徑分布Fig. 2 Particle size distribution of soybean proteins with different fermentation times

表1 發酵前后可溶性豆粕蛋白的平均粒徑和多分散系數Table 1 Average particle size and polydispersity index of soluble soybean proteins with different fermentation times

由表1可知，與原始可溶性大豆蛋白相比，經過發酵處理的可溶性大豆蛋白平均粒子直徑，隨著發酵時間延長逐漸降低。這可能是由于乳酸菌發酵可以有效的降解大豆蛋白[22]，導致可溶性大豆蛋白的平均粒徑的降低。

2.3 發酵對豆粕蛋白二級結構的影響

圖3 原始和發酵后大豆蛋白樣品的圓二光譜圖Fig. 3 Circular dichroism spectra of soybean proteins with different fermentation times

如圖3所示，所測樣品均在193 nm附近出現正峰；在219 nm附近出現負肩峰；在207 nm及222 nm處出現負臥槽；192 nm處出現的正峰及219 nm附近出現的負肩峰表示大豆蛋白結構中存在β-折疊結構，α-螺旋結構所引起的負科頓效應會使大豆蛋白在207 nm以及222 nm處形成負凹槽；220～230 nm之間出現的較弱小正峰表示大豆蛋白中有無規則卷曲的存在；β-轉角在205 nm附近有一微小正峰。由此可以看出大豆蛋白處理前后二級結構中都包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲結構的。這與通過CD-PRO軟件分析的結果（表2）一致。

由表2可知，發酵0 h時提取的大豆蛋白二級結構中β-折疊比原始大豆蛋白顯著升高（P＜0.05），這與大豆蛋白加熱處理有關。研究表明大豆蛋白加熱溫度超過80 ℃時，亞基解離，分子結構展開，導致β-折疊含量增多，同時α-螺旋結構減少[26]。發酵至3、6、9、12 h時提取的大豆蛋白與原始大豆蛋白比較二級結構中β-折疊含量均顯著升高（P＜0.05）；無規則卷曲含量均顯著降低（P＜0.05）；α-螺旋結構含量呈現隨發酵時間的延長先降低后升高。β-折疊是通過肽鏈間或肽段間的氫鍵維系，它的增多表示肽鏈間有更多的氫鍵形成，而β-折疊含量的增加有利于功能特性的改善[27]。所以，推斷發酵后提取的大豆蛋白較未發酵的蛋白具有更好的功能性質，這與前期研究結果——發酵有助于改善大豆蛋白功能性質一致[7]。這些結果說明L. plantarum發酵使大豆蛋白分子內部氫鍵排列產生了改變，同時有更多氫鍵形成，導致大豆分離蛋白構象發生改變。

圖4 大豆蛋白樣品的熒光圖譜Fig. 4 Fluorescence emission spectra for soybean protein samples

表3 大豆蛋白樣品熒光圖譜結果Table 3 Maximum fluorescence emission wavelengths of soybean protein samples fermented for different periods of time and corresponding fluorescence intensities

2.4 發酵對豆粕蛋白分子構象的影響本研究采用熒光光譜法測定蛋白質分子構象的變化，所得圖譜主要是色氨酸作為發色基團的熒光光譜，用以表征色氨酸微環境的變化。由圖4可知，發酵處理對大豆蛋白的熒光光譜形狀無顯著影響，但其最大吸收波長和熒光強度都發生改變。由表3可知，本實驗所有樣品的λmax都大于330 nm，表明色氨酸殘基都位于蛋白質分子外部的極性環境中。與原始大豆蛋白相比，發酵至0 h時提取的大豆蛋白的λmax發生紅移，目前已有研究證明，熱處理后的大豆蛋白分子內部的疏水基團會暴露出來，導致構象改變[28-29]。發酵至3、6、9、12 h時提取的大豆蛋白樣品的λmax較原始大豆蛋白的λmax紅移更為明顯，表明發酵處理可以促進色氨酸側鏈轉移到蛋白分子表面，導致蛋白質微環境極性的增加。同時發酵后大豆蛋白熒光強度降低，可能是由于發酵破壞了蛋白質結構，造成蛋白質折疊，使發色基團暴露到溶劑中，產生了溶劑猝滅作用，造成熒光強度的降低。這與圓二色譜分析中，經發酵后提取的大豆蛋白β-折疊含量增多的結果一致。

2.5 發酵對豆粕蛋白暴露巰基的影響

圖5 發酵前后對大豆蛋白暴露巰基含量的影響Fig. 5 Contents of free sulfhydryl groups of soybean protein with different fermentation times

巰基基團是大豆蛋白中重要的功能基團，巰基基團的含量與蛋白質變性有關，其他功能特性也相應發生變化，游離巰基可以分為埋藏于分子內部的巰基和暴露在蛋白質表面的巰基。由圖5可以看出，各樣品的暴露巰基含量的變化。與原始大豆蛋白相比，發酵0 h時（即經過熱處理）提取的大豆蛋白巰基含量有所降低（P＜0.05），結果與阮奇珺[30]的研究結果一致；而經過發酵處理后提取的大豆蛋白游離巰基含量顯著升高（P＜0.05），并隨著發酵時間的延長，呈現持續上升趨勢。L. plantarum在發酵過程中所產蛋白酶對大豆蛋白具有一定的降解作用，目前很多研究表明酶法改性可以提高游離巰基含量[31]。有研究表明，大豆蛋白水解物可以有效抑制巰基形成二硫鍵，具有較強的抗氧化性，阻止了游離巰基形成二硫鍵，所以游離巰基含量呈持續升高趨勢，蛋白質變性程度加強[32]。這些結果表明，發酵處理可以破壞大豆蛋白分子的內部結構，造成部分結構展開，進而將隱藏于蛋白分子內部的巰基暴露到分子表面。

2.6 發酵對豆粕蛋白微觀結構的影響

圖6 大豆蛋白樣品掃描電子顯微鏡圖（×1 000）Fig. 6 SEM images of soybean protein samples (× 1 000)

本研究利用掃描電子顯微鏡觀察大豆蛋白微觀結構的變化，電子顯微鏡掃描結果見圖6，原始大豆蛋白（圖6A）呈現較大的片狀結構，且表面十分完整，光滑。而發酵0 h表面不再光滑，而有褶皺出現；隨著發酵時間的延長，蛋白表面褶皺更為明顯，且已經形成蜂窩狀的孔洞，隨后變成較大的凹坑，并出現一些蛋白殘片，這與蛋白向粒徑減小方向移動的規律一致。發酵12 h后，大豆蛋白表面結構已經破壞殆盡，幾乎都是被腐蝕的孔洞（圖6F）。這些結果表明，在液態發酵的過程中，微生物所產的蛋白酶對大豆蛋白的酶解作用明顯。發酵前期乳酸積累量較小時，乳酸菌合成的大量蛋白酶可以降解蛋白質，形成小分子的蛋白，分子結構變得更加簡單、伸展，更易暴露。后期蛋白酶活力降低，乳酸積累量較大時，相對而言蛋白分子發生部分聚集。

3 結 論

乳酸菌具有良好降解大豆蛋白的能力。隨著L. plantarum發酵低溫脫脂豆粕乳的時間延長，樣品水解度和體外消化率均呈升高趨勢，可溶性蛋白粒徑分布向低粒徑方向移動，說明豆粕中大豆蛋白經發酵后有一定程度的降解。其次，通過發酵處理后蛋白分子結構發生了變化。發酵至3、6、9、12 h時提取的大豆蛋白與原始大豆蛋白相比，蛋白質分子進一步展開，β-折疊含量升高，同時暴露巰基含量升高。最后，掃描電子顯微鏡觀察結果表明大豆蛋白經發酵后表面不再光滑，出現腐蝕性孔洞，并且隨著發酵時間延長，孔洞更加均勻、致密。這些結果表明，經L. plantarum發酵后，豆粕蛋白的結構發生了改變，因而其功能特性得以提高。

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Effects of Lactobacillus plantarum Fermentation on the Structure of Soybean Meal Proteins

ZHANG Lili1, CUI Xian2, ZHANG Gongsheng1, JIANG Fan1, LIU Rongxu1, HAN Jianchun1,3,*
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 3. The National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150030, China)

In the present study, the structural changes of soybean proteins in aqueous suspension of skimmed soybean meal after being fermented by Lactobacillus plantarum were studied. With the extension of fermentation time, the degree of hydrolysis and in vitro digestibility of fermented samples were increased, and the particle sizes of soluble proteins became smaller. These results indicated that soybean proteins were degraded to a certain degree after fermentation. Simultaneously, the molecular structure of proteins in fermented samples was further unfolded, resulting in an increase in beta-sheet content and a decrease in alpha-helix content, as compared to the original soybean proteins and those sterilized at 0 h of fermentation. A red shift in the wavelength of maximum fluorescence emission was observed for the fermented soybean proteins. More sulfhydryl groups were exposed after fermentation. In addition, scanning electron microscopy (SEM) analysis showed that the surface of fermented soybean proteins was not as smooth as that of the original ones, with corrosion pores appearing.

Lactobacillus plantarum; soybean meal; protein structure; fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201714012

TS214.2

A

1002-6630（2017）14-0078-06

張莉麗, 崔憲, 張功圣, 等. 植物乳桿菌發酵對豆粕蛋白結構的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 78-83.

10.7506/

spkx1002-6630-201714012. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lili, CUI Xian, ZHANG Gongsheng, et al. Effects of Lactobacillus plantarum fermentation on the structure of soybean meal proteins[J]. Food Science, 2017, 38(14): 78-83. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714012. http://www.spkx.net.cn

2016-09-13

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102208）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31301545）；

中國博士后基金項目（2014M560244）；黑龍江省博士后基金項目（LBH-Z13042）；

省級科研院所基本科研業務費支持項目；中國博士后基金國際交流項目（20150082）；

東北農業大學青年才俊項目（14QC42）

張莉麗（1981—），女，副教授，博士，研究方向為蛋白質和發酵工程。E-mail：lilizhang2011@163.com

*通信作者：韓建春（1973—），男，教授，博士，研究方向為蛋白質和發酵工程。E-mail：hanjianchun@hotmail.com