瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊的制備工藝優化及其性能分析

宋嬌嬌，包秋華，王亞利，尚一娜，霍麒文，張曉寧，陳 境，李明慧，王俊國*

（內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業部奶制品加工重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊的制備工藝優化及其性能分析

宋嬌嬌，包秋華，王亞利，尚一娜，霍麒文，張曉寧，陳 境，李明慧，王俊國*

（內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業部奶制品加工重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

以乳蛋白為壁材，利用內源乳化法制備瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊，對其進行工藝優化，并比較添加不同鈣鹽作為交聯劑（CaCl2和CaCO3）對微膠囊性能的影響。結果顯示制備瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊的最佳工藝參數為：乳化攪拌速率800 r/min、水油比1∶10、脫脂乳質量濃度0.35 g/mL、鈣鹽濃度1.5 mol/L。在此條件下以CaCO3、CaCl2為交聯劑制得MG9-2微膠囊的包埋率分別為（78.4±3.6）%和（75.7±4.9）%，無顯著性差異。但與CaCl2為交聯劑制得的MG9-2微膠囊相比，CaCO3制得的微膠囊粒徑較小，表面較致密、形狀較規則、分散性較好，且具有較好的腸液釋放性和耐胃酸性。結果表明，以CaCO3為交聯劑在室溫制備瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊的工藝簡單且性能較好。

微膠囊；瑞士乳桿菌MG9-2；CaCl2；CaCO3

微膠囊包埋技術已被廣泛用來提高益生菌在不利環境中的存活率[1-3]。其中壁材和包埋方法的選擇對保護益生菌起著至關重要的作用。因蛋白質形成的凝膠具有可控的通透性和較高的凝膠強度，使其形成的微膠囊具有很好的抵抗不利環境的能力[4-5]，因此蛋白質用作益生菌的包埋壁材越來越受到人們的重視。牛乳蛋白本身可作為營養物質以及其具有較好的酸堿緩沖能力，使其成為蛋白質壁材的優良材料。牛乳蛋白是安全、營養、口感良好的乳源原料[6]，具有良好的可溶性、乳化性、成膜性、緩沖能力，在一定條件下，乳中的蛋白質能夠自我締合或與其他金屬離子及小分子結合[7-9]；此外，牛乳蛋白作為包埋壁材還有一個潛在的好處，即在消化酶的作用下可以分解產生大量的生物活性肽，為機體提供有益作用[10-11]。因此，將牛乳蛋白作為益生菌的包埋壁材具有優良的應用價值。

利用微膠囊包埋益生菌的方法很多，乳化法因其操作容易，設備簡單，很容易按比例控制乳化量，并且制備的微膠囊顆粒粒徑較小，故常用于益生菌微膠囊的制備。乳化法根據制備過程跟原理的不同分為外源乳化法和內源乳化法，外源乳化法是將壁材溶液與菌液混合，加入到油中乳化，待形成均勻的W/O乳化液，加入離子態的交聯劑（如CaCl2），使壁材彼此交聯并固化從而形成微膠囊。而內源乳化法是將壁材和難溶性的交聯劑（不溶性鈣鹽，如CaCO3）混懸液先分散到油相中形成W/O型乳化液，通過加入酸引發難溶鈣鹽中Ca2+的解離，在乳化液滴內部使壁材交聯并固化生成凝膠顆粒。相對于外源乳化法，內源乳化法制備的微膠囊直徑易于控制，且顆粒較小，分布均勻。

Heidebach等[12]開發了一種新型內源乳化方法，以凝乳酶裂解的乳蛋白片段為壁材，并以可溶性鈣鹽CaCl2作為交聯劑制備益生菌微膠囊。但此方法在制備微膠囊過程中，需要低溫裂解，升溫交聯，工藝流程相對復雜，不易掌控，不適合規模化生產。

為了簡化工藝流程，本研究嘗試用CaCO3作為交聯劑，在常溫利用內源乳化法制備益生菌微膠囊。為此，本研究以Heidebach等[12]的方法為對照，在優化微膠囊制備工藝的基礎上，對比分析兩種不同鈣鹽交聯劑（CaCl2和CaCO3）制得的微膠囊在包埋率、粒徑大小及分布、微膠囊表面及微結構、在不利環境下對菌體的保護作用等方面的差異，旨在探究一種更加適用于制備益生菌微膠囊的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑞士乳桿菌MG9-2（Lactobacillus helveticus MG9-2）內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室。

脫脂乳粉 恒天然有限公司；葵花油 金龍魚食用油有限公司；凝乳酶（1 070 U/mL）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg） 北京博奧拓達科技有限公司；CaCl2、CaCO3、冰醋酸 國藥控股股份有限公司；MRS液體培基、MRS瓊脂培養基 英國Oxoid試劑公司。

1.2 儀器與設備

RH basic1型磁力攪拌器 德國IKA公司；DM2000型顯微鏡 德國徠卡公司；SEM-SU8010型掃描電鏡 日本日立公司；MLS-3750型滅菌鍋、STAC-S45F型恒溫培養箱 日本三洋公司；KDC-1044型低速離心機 安徽中佳科儀有限公司；超低溫冰箱 中國海爾集團公司；pH計 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養

將瑞士乳桿菌MG9-2接種于MRS液體培養基，活化3 代后，在3 000 r/min條件下離心10 min，收集菌泥，重懸于滅菌水中得到濃縮菌液，使此濃縮菌液的菌密度約109CFU/mL，混勻后用MRS瓊脂培養基傾注培養，對該濃縮菌液進行精確計數。

1.3.2 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊的制備工藝優化

1.3.2.1 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊的制備

CaCl2交聯微膠囊的制備參照Heidebach等[12]的方法：將30 g菌乳混合液置于冰浴中，加入400 μL凝乳酶恒定速率攪拌（500 r/min）以降解酪蛋白，待降解完全后，再加入180 μL不同濃度的CaCl2溶液，保持恒速攪拌，使之混合均勻后，吸取10 g此混合液加入到預冷的葵花油中，繼續恒速攪拌，此階段需嚴格控制溫度（低于5 ℃），待體系形成均勻的W/O乳狀液后，提高體系溫度至40 ℃，此時，乳狀液滴立即轉變成凝膠顆粒，選擇不同的乳化攪拌速率，乳化15 min，離心（1 200 r/min，1 min）、洗滌，去除油相層，收集微膠囊顆粒，貯藏于4 ℃備用。

CaCO3交聯微膠囊的制備參照Silva等[13]的方法：將30 g菌乳混合液置于冰浴中，加入400 μL凝乳酶恒定速率攪拌（500 r/min）以降解酪蛋白，待降解完全后，再加入180 μL不同濃度CaCO3懸濁液，繼續恒速攪拌，吸取10 g此混合液加入到葵花油中，選擇不同的乳化攪拌速率，在常溫乳化15 min，待混合物形成均勻的W/O型乳化液，向體系中加入60 μL 8.5mol/L冰醋酸溶液，引發不容性鈣鹽中Ca2+的完全解離，促使Ca2+在乳液液滴內部與酪蛋白作用生成凝膠顆粒，靜置30 min，離心、洗滌，收集凝膠顆粒，貯藏于4 ℃備用。

1.3.2.2 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊制備正交試驗優化

在設定相關因素參數為固定值的前提下，分別考察乳化攪拌速率（200、400、600、800、1 000 r/min），水油比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12），水相中脫脂乳質量濃度（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/mL），鈣鹽濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L）對微膠囊的包埋率和粒徑的影響，在單因素試驗結果的基礎上，通過正交分析法確定微膠囊制備的最佳工藝參數。

1.3.3 兩種包埋方法對瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊性能的影響

1.3.3.1 微膠囊的包埋率測定

模擬腸液的配制：參照Mokarram等[14]的方法，用NaOH溶液將NaCl溶液（8.5 g/L）的pH值調節到8.0，然后按0.1 g/mL加入胰蛋白酶，最后用0.22 μm的膜進行過濾除菌。

稱取0.5 g濕微膠囊加入到4.5 mL預熱的模擬腸液中，37 ℃、180 r/min條件下溫育2.5 h，使菌體完全釋放，然后取樣梯度稀釋，采用傾注法于MRS瓊脂培養基，然后在37 ℃培養48 h后活菌計數。包埋率計算公式如下：

式中：微膠囊中活菌數量為每克濕微膠囊的含菌量與收集得到微膠囊總質量的乘積；初始活菌數量為每毫升濃縮菌液的含菌量與加入濃縮菌液總體積的乘積。

1.3.3.2 微膠囊的形態觀察及粒徑的分析

通過徠卡顯微鏡觀測微膠囊的粒徑大小及其分布：取20 μL微膠囊分散液均勻置于載玻片上，觀察微膠囊的形態特征，并對載玻片上濕態微膠囊進行隨機取樣并拍照，通過Leica Qwin軟件對60 個隨機取樣的微膠囊進行粒徑分析并測量[15]。另外，用亞甲藍染液對載玻片上的微膠囊進行染色，進一步觀察微膠囊崩解的情況及其所包含菌體的形態。

通過掃描電子顯微鏡觀察微膠囊的超微結構：用雙面膠將自然干燥后的微膠囊干粉粘在樣品臺上，噴金后用掃描電鏡觀察微膠囊表面結構。

1.3.3.3 微膠囊在模擬腸液中的崩解實驗

取0.5 g濕微膠囊，將其分散于4.5 mL預熱的模擬腸液中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養2.5 h，在30、60、90、120、150 min時取樣，并按1.3.3.1節方法計算釋放到模擬腸液中的活菌數。

1.3.3.4 微膠囊在模擬胃液中的存活實驗

模擬胃液的配制：參照Dolly[16]、Rajam等[17]的方法，用濃鹽酸將NaCl溶液（8.5 g/L）的pH值調節到2.0，加入3 g/L的胃蛋白酶溶液，最后用0.22 μm的膜進行過濾除菌。分別取0.5 g濕微膠囊和0.5 mL MG9-2濃縮菌液（空白對照），將其分散于預熱的4.5 mL模擬胃液中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養，分別在30、60、90、120、150 min取樣，轉入預熱的模擬腸液中釋放，按1.3.3.1節方法進行計數。

1.4 數據統計分析

所有獨立實驗至少重復3 次，應用SPSS 22.0統計軟件對各實驗數據進行方差分析和顯著性檢驗；采用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊制備工藝的優化

2.1.1 單因素試驗結果

2.1.1.1 乳化攪拌速率對微膠囊性能的影響

圖1 攪拌速率對微膠囊包埋率和粒徑的影響Fig. 1 Effects of stirring speed on microencapsulation efficiency and microcapsule size

在水油比1∶8、脫脂乳質量濃度0.30 g/mL、鈣鹽濃度1.0 mol/L的條件下，考察乳化攪拌速率分別為200、400、600、800、1 000 r/min時對微膠囊的包埋率和粒徑的影響。如圖1所示，隨著乳化攪拌速率的增加，兩種微膠囊包埋率和粒徑大小均發生顯著變化（P＜0.05），與Silva等[13]發現的結果一致。在攪拌速率600、800 r/min時，CaCO3、CaCl2為交聯劑制得的微膠囊的包埋率較高，分別為（59.15±3.71）%、（57.87±3.44）%和（56.77±3.74）%、（56.54±3.16）%，CaCO3制得的微膠囊的粒徑大小分布于100～120 μm，CaCl2制得的微膠囊粒徑大小分布于130～155 μm。

當攪拌速率小于600 r/min時，微膠囊的包埋率較低，推測原因可能是低速的攪拌造成乳化過程較慢且乳化不完全，從而影響微膠囊的生成和粒徑的大小；而攪拌速率大于800 r/min時，微膠囊的包埋率隨著攪拌速率的增大而下降，其原因可能是攪拌速率過大時，強大作用力對微膠囊結構產生破壞，進而減小微膠囊的包埋率和粒徑。

2.1.1.2 水油比對微膠囊性能的影響

圖2 水油比對微膠囊包埋率和粒徑的影響Fig. 2 Effects of water-oil-ratio on microencapsulation efficiency and microcapsule size

在乳化攪拌速率800 r/min、脫脂乳質量濃度0.30 g/mL、鈣鹽濃度1.0 mol/L的條件下，考察水油比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12時對微膠囊的包埋率和粒徑的影響。由圖2可知，隨著油比例的增加，兩種微膠囊的包埋率均顯著升高（P＜0.05），相反，微膠囊的粒徑則隨之減小。當水油比在1∶10和1∶12時，CaCO3、CaCl2為交聯劑制得的兩種微膠囊的包埋率處于同一顯著水平，分別在59%～63%和58%～63%之間，此時，在水油比為1∶12時，微膠囊在電子顯微鏡下觀察形態不規則（圖3），水油比為1∶10時，兩種微膠囊的呈球形。

圖3 微膠囊在電子顯微鏡下的形態Fig. 3 Electron microscope image of microcapsules

在油比例較低時，在顯微鏡下觀察到制得的微膠囊囊壁較薄，隨著攪拌、離心、洗滌等外界機械力的作用容易破裂，因此，微膠囊的包埋率較低但粒徑較小，且形態較規則；當水油比在1∶12時，微膠囊的包埋率相對較高，粒徑相對于在1∶10時的粒徑較小，但其形態不規則，推測原因可能是由于單位乳化劑中的微膠囊含量較高，在攪拌的過程中球形顆粒相互擠壓，使微膠囊的形態受到了一定的影響。

2.1.1.3 脫脂乳質量濃度對微膠囊性能的影響

在乳化攪拌速率800 r/min、水油比1∶8、鈣鹽濃度1.0 mol/L的條件下，考察脫脂乳質量濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/mL時對微膠囊的包埋率和粒徑的影響。由圖4可知，壁材的質量濃度對微膠囊的包埋率和粒徑有著重要的影響（P＜0.05）。隨脫脂乳質量濃度增加，兩種微膠囊包埋率均呈先上升后下降的趨勢，在脫脂乳質量濃度達到0.35 g/mL時，CaCO3、CaCl2微膠囊的包埋率均達到最高值，分別為（66.02±3.46）%和（65.07±2.02）%；兩種微膠囊的粒徑均隨脫脂乳的濃度增加呈急劇上升趨勢。Liu Xianqiao等[18]發現當低濃度海藻酸鈉包埋時微膠囊的包埋率很低，很難形成球形，隨著海藻酸鈉濃度升高，微膠囊的包埋率顯著升高，且形成的粒徑較大。

圖4 脫脂乳質量濃度對微膠囊包埋率和粒徑的影響Fig. 4 Effects of skim milk concentration on microencapsulation efficiency and microcapsule size

當脫脂乳質量濃度小于0.25 g/mL時，此時乳蛋白含量過少，在溶液中濃度太低，與鈣離子的交聯難度大，菌株不能被完全包埋。同時，兩種微膠囊的質地均較細膩松散，在離心洗滌除去油脂時微膠囊結構易破壞，平板計數結果發現離心洗滌液中有大量游離瑞士乳桿菌

MG9-2，因此，兩種微膠囊的包埋率均相對較低；而隨著脫脂乳質量濃度的升高，乳化形成的蛋白質片段相互締合，形成的微膠囊壁材強度增大，囊壁增厚，包埋率增高；當脫脂乳質量濃度達到0.35 g/mL時，再增加脫脂乳質量濃度，即蛋白質量濃度增高的同時，黏度也隨之增加，在油相中分散較困難，易形成較大的蛋白網狀結構，使得凝膠過早形成，從而形成多孔、粒徑大而不均一的凝膠顆粒，在顯微鏡下觀察到部分微膠囊相互黏連，形態不規則。為了不影響食品的感官特性，應嚴格控制壁材用量。

2.1.1.4 鈣鹽濃度對微膠囊性能的影響

圖5 鈣鹽濃度對微膠囊包埋率和粒徑的影響Fig. 5 Effects of calcium salt concentration on microencapsulation efficiency and microcapsule size

在乳化攪拌速率800 r/min、水油比1∶8、脫脂乳質量濃度0.30 g/mL的條件下，考察鈣鹽濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L時對微膠囊的包埋率和粒徑的影響。如圖5所示，不同鈣鹽濃度對微膠囊的包埋率有著極為重要的影響，而對微膠囊粒徑的影響較小。隨鈣鹽濃度的增加，兩種微膠囊的包埋率均發生顯著變化（P＜0.05），當鈣鹽濃度為1.5 mol/L，兩種微膠囊的包埋率顯著高于其他組（P＜0.05），此時，CaCO3、CaCl2微膠囊的包埋率分別為（66.77±2.80）%和（65.00±3.10）%。許多研究也證實鈣鹽誘導凝膠形成的凝膠體系穩定[19-20]。原因可能是Ca2+自身化合價較高，使得其屏蔽蛋白質分子間靜電力的作用較大，此外，Ca2+可在帶負電荷的蛋白質分子之間形成鹽橋，最終導致的Ca2+凝膠能力強于類型鹽離子的凝膠能力[21]。

當鈣鹽濃度較低時，不利于Ca2+和脫脂乳的完全交聯，從而影響凝膠的效果，降低了MG9-2微膠囊的包埋率；相反，適當增加Ca2+的濃度，其誘導形成凝膠的脆性、硬度也隨之增加[22-23]，能顯著提高MG9-2微膠囊的形成，然而當鈣鹽濃度大于2.0 mol/L時，兩種微膠囊的包埋率顯著降低（P＜0.05），原因是Ca2+濃度過高有可能會導致滲透壓升高，而高滲透壓對益生菌有致死作用[24]。

2.1.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選擇乳化攪拌速率（400、600、800 r/min）、水油比（1∶6、1∶8、1∶10）、脫脂乳質量濃度（0.25、0.30、0.35 g/mL）、鈣鹽濃度（1.0、1.5、2.0 mol/L）因素進行正交試驗，以微膠囊的包埋率和粒徑為評價指標確定最佳工藝條件。MG9-2微膠囊工藝條件優化設計與結果見表1和表2。

表1 CaCO3為交聯劑制備微膠囊工藝優化L9（34）的正交試驗結果Table 1 Orthogonal array design L9(34) together with experimental results for optimization of microencapsulation with CaCO3

表2 CaCl42為交聯劑制備微膠囊工藝優化L9（3）的正交試驗結果Table 2 Orthogonal array design L49(3) together with experimental results for optimization of microencapsulation with CaCl 2

包埋率是評價微膠囊的重要指標，因為保持益生菌在微膠囊中的活性對其實現益生功效十分重要。同時，粒徑大小決定微膠囊能否直接應用于食品中，由于微膠囊的粒徑大小會影響食品的品質和口感，且形狀又決定了其在食品中的流動性，故只有當益生菌微膠囊的粒徑較小、形狀較規則時，食品的品質才不會受到影響[25-26]。

由表1和表2可知，影響兩種微膠囊包埋率因素的主次順序均為脫脂乳質量濃度（C）＞鈣鹽濃度（D）＞水油比（B）＞攪拌速率（A），因此，以包埋率為評價指標，兩種微膠囊最佳的工藝組合水平為A2B3C3D2；影響兩種微膠囊粒徑大小因素的主次順序均為攪拌速率（A）＞脫脂乳質量濃度（C）＞水油比（B）＞鈣鹽濃度（D），以粒徑大小為評價指標，兩種微膠囊最佳的工藝組合水平為A3B2C1D1。根據正交試驗的綜合平衡法，以包埋率為主要的評價指標，且考慮微膠囊粒徑大小的因素，確定兩種微膠囊最佳的工藝參數為乳化攪拌速率800 r/min、水油比1∶10、脫脂乳質量濃度0.35 g/mL、鈣鹽濃度1.5 mol/L，在此條件下以CaCO3、CaCl2為交聯劑制得的微膠囊包埋率分別為（78.4±3.6）%和（75.7±4.9）%，均顯著高于其他組（P＜0.05）。兩種微膠囊制備的最佳工藝參數均一致，可能是兩種方法制備微膠囊的過程中凝乳酶的活力及其添加量、壁材和乳化油等重要條件均完全相同。

2.2 兩種微膠囊的包埋率比較

包埋率是評價微膠囊的重要指標，結果顯示, 以CaCO3為交聯劑制得的MG9-2微膠囊的包埋率為（78.4±3.6）%，以CaCl2為交聯劑制得的MG9-2微膠囊的包埋率為（75.7±4.9）%，兩種方法制得微膠囊的包埋率均較高，無顯著性差異。許多研究也證實Ca2+凝膠能力較強[27-28]，其機理是蛋白質在熱誘導條件下，使其分子中的疏水基團暴露，形成的蛋白質凝聚物依靠彼此之間的靜電排斥力作用，形成穩定的分散體系。而鹽離子的加入，通常可以通過屏蔽電子或者特殊離子的疏水相互作用而使蛋白質凝聚物聚集最終形成凝膠。鈣離子除了上述作用外，可以與蛋白質凝聚物所帶的負離子基團作用，在蛋白質之間通過鈣離子形成鹽橋，進而形成穩定的凝膠體系。

不同鈣鹽（CaCO3和CaCl2）交聯劑誘導凝膠的方式不同，CaCl2為交聯劑制得微膠囊是基于溫度誘導而形成凝膠，因為κ-酪蛋白在低溫可被凝乳酶裂解，但在低溫酪蛋白不能與Ca2+交聯形成凝膠，當溫度升高至18～20 ℃時，會形成凝膠顆粒將MG9-2包埋，但此方法需要低溫裂解，再升溫交聯，工藝流程過于復雜，不易掌控。而CaCO3制得微膠囊是基于酸誘導瞬間形成的，是由于將水溶性酸添加到油相中，可使得有機酸立即分配到水相中，從而瞬間降低液滴pH值，引發不溶性鈣鹽中Ca2+在W/O型乳液液滴內部釋放，并與酪蛋白交聯快速形成凝膠顆粒，將MG9-2包埋于微膠囊內部，此方法在室溫即可反應形成凝膠顆粒，工藝操作簡單，容易控制。

2.3 兩種微膠囊的粒徑及分布比較

圖6 兩種微膠囊在光學顯微鏡下的形態Fig. 6 Optical images of two different microcapsules

圖7 兩種微膠囊的粒徑分布Fig. 7 Mean size distributions of two different microcapsules

粒徑大小及其分布對微膠囊能否直接應用于食品至關重要。本研究使用徠卡顯微鏡測定了兩種微膠囊的粒徑大小及其分布，結果顯示，CaCl2為交聯劑制得的微膠囊的平均粒徑為（152.37±10.19） μm，而CaCO3為交聯劑制得的微膠囊的平均粒徑較小為（102.38±6.23）μm；在圖6光學顯微鏡下也可觀察到CaCO3微膠囊的粒徑較小，且分散性較好，而CaCl2微膠囊的粒徑較較大，容易聚集；由圖7可知，以CaCl2為交聯劑得到的MG9-2微膠囊粒徑分布較廣，75%的顆粒分布于120～160 μm，而以CaCO3為交聯劑得到的MG9-2微膠囊粒徑分布相對較窄，80%的顆粒分布于90～120 μm。

在乳化法中，壁材含量、水油比、攪拌速率等是控制微膠囊的粒徑及其分布的重要參數[29-30]。但在本實驗中，這些因素參數在這兩種制備微膠囊方法均相同，故兩種微膠囊的粒徑及其分布之間的差異主要是兩種鈣鹽誘導的方式不同造成的。對CaCl2微膠囊來說，低溫時可溶性CaCl2已均勻地分散于乳狀液中，與酪蛋白充分接觸，當溫度升高，Ca2+不僅在乳狀液內部進行交聯，同時也將兩個或多個顆粒交聯在一起，故以CaCl2為交聯劑得到的MG9-2微膠囊常聚集在一起，粒徑較大，分散性不好[31]；Esquisabelr等[32]研究了微膠囊粒徑大小與油脂黏度間的關系，得出的結論黏度越大，微膠囊粒徑越小。此方法的凝膠是在40 ℃條件下形成的，隨著溫度的升高，油脂的黏度降低，可能會引起凝膠顆粒的生成較大。而CaCO3微膠囊是由于冰醋酸引發不容性鈣鹽中Ca2+在W/O型乳液液滴內部釋放，并與酪蛋白交聯而形成的，故CaCO3微膠囊的粒徑主要取決于分散相之間的平衡及凝膠顆粒的表面張力，因此，以CaCO3為交聯劑得到的MG9-2微膠囊粒徑更小，分散性更好[33]，此方法制得的益生菌微膠囊更適合添加于食品中。

2.4 兩種微膠囊表觀形態的比較

圖8 兩種微膠囊的掃描電鏡圖Fig. 8 SEM images of two different microcapsules

圖8 為兩種微膠囊經亞甲藍染色后的形態，可以看到兩種微膠囊中均有大量的菌體存在，證實了MG9-2被包埋于微膠囊中。CaCO3微膠囊呈均勻球形，表面較致密，光滑（圖8A1和8A2），CaCl2微膠囊呈球性較差，且微膠囊表面疏松多孔（圖8B1和8B2），此外，CaCO3微膠囊球狀規則，分布均勻（圖8A3），CaCl2微膠囊不規則的聚集體隨處可見（圖8B3）。

CaCl2微膠囊制備過程中，可溶性鈣鹽CaCl2不僅在乳狀液內部進行交聯，同時也將兩個或多個顆粒交聯在一起，因此形成的凝膠顆粒容易凝聚（圖8B3），且凝膠顆粒受力不均勻，造成MG9-2微膠囊形狀不規則，結構疏松[34]。相反，冰醋酸瞬間引發CaCO3中Ca2+在W/O型乳液液滴內部釋放，并與酪蛋白在乳液液滴內部交聯，故形成的微膠囊粒徑更小、更均勻、分散性更好。因此，以CaCO3為交聯劑制得的MG9-2微膠囊呈均勻球狀，且結構更加致密、粒徑更小、分散性更好，故CaCO3微膠囊更適合添加至食品中。

2.5 兩種微膠囊在模擬腸液中釋放性的比較

圖9 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊崩解圖Fig. 9 Disintegration of microcapsules

兩種微膠囊在模擬腸液中不同時間的崩解情況如圖9所示，經亞甲藍染色觀察可知微膠囊崩解過程中，牛乳蛋白壁材在模擬腸液中逐步分解，蛋白質逐漸分解成網狀交聯的小片段，最終將瑞士乳桿菌MG9-2釋放完全。由圖9A2和9B2可知，微膠囊在模擬腸液中30 min時，大部分CaCO3為交聯劑制得的微膠囊完成崩解，此時只有一小部分CaCl2為交聯劑制得微膠囊崩解完成。

圖10 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊在模擬腸液中的釋放性Fig. 10 Release characteristics of encapsulated L. helveticus MG9-2 in simulated intestinal fluid (SIF)

由圖10可知，兩種鈣鹽制得的微膠囊均可在90 min內完全釋放，CaCO3為交聯劑制得的微膠囊70%的菌體是在30 min內釋放的；而CaCl2微膠囊在30 min時僅釋放40%的菌體，故表明CaCO3微膠囊的腸液釋放性明顯較好。Annan等[35]比較了不同乳化方法對益生菌在模腸液中釋放性的影響，結果發現，相比于內源乳化法方法，外源乳化法方法制備得到的微膠囊容易成簇聚集，在模擬腸液中釋放的時間較長。因此推測，兩種微膠囊在腸液中釋放速度的差異主要是由于微膠囊粒徑大小及微結構的不同。本研究中，CaCO3微膠囊比CaCl2微膠囊粒徑較小、分布較均勻、分散性較好，腸液與微膠囊接觸的比表面積較大，酶的作用空間較大[36]，故腸液釋放性較好，更有利于瑞士乳桿菌MG9-2在腸道中的生長和定植。

2.6 兩種微膠囊在模擬胃液中存活性的比較

圖11 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊在模擬胃液中的存活性Fig. 11 Survival of encapsulated L. helveticus MG9-2 in simulated gastric fluid (SGF)

由圖11可知，瑞士乳桿菌MG9-2菌株的耐胃酸性較差，在pH 2.0的模擬胃液中處理150 min，活菌數減少了2（lg（CFU/g））。這與許多研究一致，Heidebach等[12]將Lactobacillus paracasei F19在pH 2.5的模擬胃液中60 min后，菌的活性幾乎全部喪失。而將MG9-2包埋于以脫脂乳為壁材的微膠囊中可以顯著提高其在模擬胃液中的存活率（P＜0.05），且兩種方法制得的微膠囊在模擬胃液中處理150 min后，活菌數均高于8.0（lg（CFU/g））。推測微膠囊較強的耐胃酸性可能是由于脫脂乳的緩沖作用和微膠囊表面的低滲透性，該結論與許多研究一致，在鄒強等[37]的分別以乳清蛋白和海藻酸鈉包埋Bifidobacterium bifidum F-35，結果發現乳清蛋白微膠囊具有較好的耐胃酸性，這是由于乳清蛋白分子具有許多堿性的氨基酸殘基，所以在偏中性的環境中，乳清蛋白具有較高的緩沖能力，在雙歧桿菌微膠囊內部，這些氨基酸殘基能夠中和滲透進入的H+，從而維持一個pH值偏中性的內部環境，保持雙歧桿菌的活性。Doherty等[38]以乳清蛋白包埋益生菌，在模擬胃液3 h中益生菌微膠囊表現出較高的耐胃酸性，他認為微膠囊較強的耐胃酸性主要由于乳清蛋白良好的緩沖作用；Heidebach等[12]發現將以酪蛋白包埋Bifidobacterium lactis Bb12，在pH 2.5的模擬胃液中處理90 min后，能夠將B. lactis Bb12的存活率提高2 個對數值。

由圖11可知，CaCO3微膠囊在模擬胃液中處理150 min后MG9-2活菌數降至8.419 （lg（CFU/g）），而CaCl2微膠囊在模擬胃液中處理150 min后活菌數降至8.034（lg（CFU/g）），且CaCl2微膠囊中的活菌數在30 min時開始顯著下降，而CaCO3微膠囊的活菌數在90 min后才開始顯著下降，因此，可以認為CaCO3微膠囊保護MG9-2抵御胃酸環境的性能顯著優于CaCl2微膠囊。其原因可能是兩種微膠囊表面結構之間的差異（圖8），CaCl2微膠囊表面較疏松多孔，胃液容易滲入破壞菌體；而CaCO3微膠囊表面較為致密光滑，能較好地抵御胃液的滲透，更好地保護被包埋的瑞士乳桿菌MG9-2。

3 結 論

本實驗以CaCO3和CaCl2為交聯劑分別交聯乳蛋白，利用內源乳化法制備瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊，以正交試驗確定MG9-2微膠囊制備的最佳工藝參數：乳化攪拌速率800 r/min、水油比1∶10、脫脂乳質量濃度0.35 g/mL、鈣鹽濃度1.5 mol/L。

研究表明，鈣鹽及其誘導交聯方法的不同顯著影響微膠囊的性能，以CaCO3、CaCl2為交聯劑制得MG9-2微膠囊的包埋率分別為（78.4±3.6）%和（75.7±4.9）%，兩種微膠囊的包埋率無顯著性差異；以CaCO3為交聯劑制得的MG9-2微膠囊粒徑（102.38±6.23）μm較CaCl2微膠囊粒徑（152.37±10.19）μm小，其表面更加致密、形狀更規則、分散性更好；在模擬腸液中，CaCO3和CaCl2兩種交聯劑制得的微膠囊均可在90 min內完全釋放，CaCO3為交聯劑制得的微膠囊70%的菌體即可在30 min內釋放完全，而CaCl2微膠囊在30 min時僅釋放40%的菌體；CaCO3微膠囊在模擬胃液中處理150 min后，LIP-1活菌數降至8.419（lg（CFU/g）），而CaCl2微膠囊在同樣條件下處理150 min后活菌數降至8.034（lg（CFU/g））。因此，以CaCO3為交聯劑經酸誘導制得的MG9-2微膠囊性能較好；且此方法在室溫即可形成凝膠，制備過程簡單、工藝容易控制，該研究為益生菌微膠囊制備提供參考。

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Optimization of Preparation Process and Properties of Microcapsules Containing Lactobacillus helveticus MG9-2

SONG Jiaojiao, BAO Qiuhua, WANG Yali, SHANG Yina, HUO Qiwen, ZHANG Xiaoning, CHEN Jing, LI Minghui, WANG Junguo*
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, Key Laboratory of Dairy Processing, Ministry of Agriculture, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Lactobacillus helveticus MG9-2 was microencapsulated with milk protein as wall material by means of emulsification/internal gelation. The preparation process was optimized, and the effect of different calcium salts (CaCO3and CaCl2) as crosslinking agents on microencapsulation efficiency was investigated. The results showed that the optimal process parameters were as follows: stirring speed, 800 r/min; water-to-oil ratio, 1:10; concentration of skim milk, 0.35 g/mL; and concentration of calcium salt, 1.5 mol/L. Under these conditions, the microencapsulation efficiency (ME) of viable cells with CaCO3and CaCl2were (78.4 ± 3.6)% and (75.7 ± 4.9)%, respectively, with no significant difference being observed between them. Microcapsules prepared with CaCO3were smaller in size than those prepared with CaCO3, exhibiting a more compact surface, and a more regular spherical shape and a narrower size distribution and displaying a better resistance to intestinal release and gastric acid. The findings demonstrated that microcapsules with improved properties could be prepared more simply using CaCO3as crosslinking agent than CaCl2.

microencapsulation; Lactobacillus helveticus MG9-2; CaCl2; CaCO3

10.7506/spkx1002-6630-201714008

TS252

A

1002-6630（2017）14-0049-09

宋嬌嬌, 包秋華, 王亞利, 等. 瑞士乳桿菌MG9-2微膠囊的制備工藝優化及其性能分析[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 49-57.

10.7506/spkx1002-6630-201714008. http://www.spkx.net.cn SONG Jiaojiao, BAO Qiuhua, WANG Yali, et al. Optimization of preparation process and properties of microcapsules containing Lactobacillus helveticus MG9-2[J]. Food Science, 2017, 38(14): 49-57. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714008. http://www.spkx.net.cn

2016-09-13

國家自然科學基金地區科學基金項目（31160315；31660456）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31301516）；內蒙古自然科學基金項目（2015MS0306）；中國科學院西部之光人才培養項目

宋嬌嬌（1991—），女，碩士研究生，研究方向為乳品微生物。E-mail：15661136791@163.com

*通信作者：王俊國（1970—），男，教授，博士，研究方向為乳品工藝學。E-mail：junguo379@aliyun.com