骨疏顆粒對骨質疏松大鼠骨形成和骨吸收標志物的影響

杜義斌　郭文清　嚴繼林

摘要：目的觀察骨疏顆粒對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝指標的影響。方法選擇SD大鼠90只，空白對照組（假手術組）15只，手術造模組75只。造模組切除卵巢復制絕經后骨質疏松癥模型。將造模成功大鼠隨機分為模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒高、中、低劑量組5組，每組12只。空白對照組、模型組給予生理鹽水10ml/（kg.d）灌胃；戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片0.09mg/（kg.d）灌胃；骨疏顆粒高、中、低劑量組分別按照高劑量5.4 g/（kg.d），中劑量2.7 g/（kg.d），低劑量1.35 g/（kg.d）灌胃。連續灌胃12周。收集各組大鼠尿液、股動脈血。檢測血ca、血P、尿ca、尿Cr、0c、ALP、TRAP、DPD及尿Ca/Cr。結果骨疏顆粒高劑量組血Ca濃度與戊酸雌二醇組無差異（P>0.05）；骨疏顆粒高中低劑量組0C均高于戊酸雌二醇組（P<0.05）；骨疏顆粒高劑量組ALP及TRACP與戊酸雌二醇組比較無差異（P>0.05）；骨疏顆粒高中低劑量組DPD均低于戊酸雌二醇組（P<0.05），骨疏顆粒高劑量組與戊酸雌二醇組Ca/Cr無差異（P>0.05）。結論骨疏顆粒與戊酸雌二醇均能降低骨吸收標志物，增加骨形成標志物，改善絕經后大鼠骨質疏松相關指標。

關鍵詞：骨質疏松；骨疏顆粒；骨形成標志物；骨吸收標志物；動物實驗

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）03-0068-04

絕經后骨質疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMPO）常見和多發于絕經后婦女，雌激素缺乏是主要病因。隨著我國人口老齡化不斷加劇，由骨質疏松癥導致老年人發生骨折和（或）致殘的住院率不斷上升，這已成為棘手的公共衛生問題。骨疏顆粒是本院治療骨質疏松癥的科研觀察用藥，前期試驗研究顯示，該方能改善骨質疏松癥相關癥狀，提高腰椎骨密度水平。為進一步揭示骨疏顆粒的抗骨質疏松機制，筆者開展了該項研究，探討骨疏顆粒對骨形成、骨吸收等骨代謝相關指標的影響。

1資料與方法

1.1造模與分組 清潔級健康雌性未孕SD大鼠90只，3月齡，體重（250±20）g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供，合格證號：SCXK（滇）2015-0002。實驗室環境溫度20-25℃，濕度40%-50%。實驗動物飼養于昆明醫科大學實驗動物學部。

適應性喂養1周后，隨機抽取大鼠15只作為假手術組，余75只作為手術造模組。手術造模組通過手術切除雙側卵巢的方法建立絕經后骨質疏松癥動物模型，假手術組不切除卵巢僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。術后12周，手術造模組與假手術組各隨機抽取2只大鼠，取其左后肢股骨進行病理組織切片確定造模成功。將手術造模組存活的60只大鼠隨機分為模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒高劑量組、骨疏顆粒中劑量組、骨疏顆粒低劑量組5組，每組12只；假手術組作為空白對照組。分別進行相應藥物干預，空白對照組、模型組給予生理鹽水10ml/（kg.d）灌胃，持續12周；戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片0.09mg/（k昏d）灌胃，持續12周；骨疏顆粒高、中、低劑量組分別按照高劑量5.4 g/（kg.d），中劑量2.7 g/（kg.d），低劑量1.35 g/（k昏d）灌胃，持續12周。實驗全程普通飼料喂養，自由進食、進水。相應藥物干預12周后，在處死前將大鼠置于代謝籠內收集尿液，離心后冰凍保存待檢；接下來處死全部實驗大鼠，股動脈取血，離心后冰凍保存待檢。

1.2藥品與試劑

1.2.1藥品 骨疏顆粒：云南中醫學院第一附屬醫院制劑中心提供，由狗脊、黃芪、白術、三七、獨活等藥組成，10g/袋；戊酸雌二醇片（補佳樂）：拜耳醫藥保健有限公司生產，1 mg×21片/盒。生產企業：DELPHARM lille S.A S；進口藥品注冊證號：H20120368；藥品批準文號：國藥準字J20130009。

1.2.2試劑 生化指標試劑盒（武漢優爾生生物科技股份有限公司生產）；骨代謝標志物：骨形成標志物血清骨鈣素（OC）（批號201603029）、血清堿性磷酸酶（ALP）（批號P0321），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（批號P0332）、尿脫氧吡啶啉（DPD）（批號P0341）。

1.3實驗方法

1.3.1造模 應用Saville手術切除雌性大鼠雙側卵巢的方法建立絕經后骨質疏松癥動物模型，假手術組不切除卵巢。喂養12周后，假手術組、手術造模組各隨機抽取2只大鼠取左后肢股骨行病理切片確定造模成功與否。

1.3.2給藥方法 造模成功后，將手術造模組60只大鼠隨機分為模型對照組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒高劑量組、骨疏顆粒中劑量組、骨疏顆粒低劑量組5組，每組12只；假手術組作為空白對照組，分別進行不同藥物干預。空白對照組、模型對照組給予生理鹽水10 mL/（kg.d）灌胃，持續12周；戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片0.09 mg/（kg.d）灌胃，持續12周；骨疏顆粒高、中、低劑量組分別按照高劑量5.4 g/（kg.d），中劑量2.7 g/（kg.d），低劑量1.35 g/（kg.d）灌胃，持續12周。實驗全程普通飼料喂養，自由進食、進水。

1.3.3觀察指標及檢測方法 （1）血Ca、血P、尿Ca、尿Cr使生化法進行檢測；（2）OC、ALP、TRAP、DPD檢測，使用ELISA法檢測；（3）大鼠左后肢股骨骨病理檢測骨小梁數、骨小梁面積百分數、骨小梁分離度、骨小梁厚度。骨標本取材及制備：用3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后股動脈徹底抽血處死，分離股骨，去除肌肉，將骨樣本置于10%磷酸鹽緩沖液配制的甲醛溶液中固定24 h，再經70%乙醇脫水后，用特殊骨染料染色5天。以后用50%乙醇開始逐級脫水及丙酮脫脂，最后用甲丙烯酸甲酯包埋不脫鈣骨，包埋塊干后鋸成300 mm骨片，經磨成20 mm的薄片再次梯度脫水，透明封固。

1.4統計學分析方法 應用SPSS 20.0統計軟件進行分析。多組間比較根據資料的性質不同，分別選用One-Way ANO-VA和Kruskal-Wallis Test的比較方法。單因素方差分析用于完全隨機設計的多個樣本均數間的比較，其統計推斷是推斷各樣本所代表的各總體均數是否相等。方差分析的兩個基本假設：1）各樣本是相互獨立的隨機樣本，均服從正態分布；2）各樣本的總體方差相等，即方差齊性（homogeneityofvari-ance）。若不能滿足以上兩個條件，采用Kruskal-Wallis Test非參數方法。

2實驗結果

2.1大鼠存活情況 假手術組大鼠，手術中及術后死亡2只，造模組大鼠手術手術中及術后死亡15只。灌胃操作致使大鼠死亡7只。試驗后期空白對照組大鼠精神狀況良好，被毛光澤；模型組大鼠蜷縮嗜睡，活動較少，被毛無光澤且有脫落；戊酸雌二醇組與骨疏顆粒不同劑量組大鼠活動尚可，精神狀況良好。

2.2造模成功的判定 觀察統計2組大鼠左后肢股骨骨組織病理片骨小梁數、骨小梁面積百分、骨小梁分離度、骨小梁厚度數據比較見表1。

表-1可知，骨小梁數、骨小梁面積百分數、骨小梁分離度、骨小梁厚度4項指標假手術組與手術造模組間之間差異有統計學意義（P<0.01），假手術組的骨小粱數、骨小梁面積百分比、骨小梁厚度均高于手術造模組，假手術組骨小梁分離度低于手術造模組。兩組間比較：手術造模組出現嚴重骨質疏松，說明造模成功。

2.3各組大鼠血清礦物質水平比較 見表2。

表2可知，與空白對照組比較，模型組血鈣明顯高于空白對照組（P<0.01），與模型組比較，骨疏顆粒高劑量組和戊酸雌二醇組血鈣濃度明顯低于模型組（P<0.01），與戊酸雌二醇組比較，骨疏顆粒高劑量組血鈣濃度與之無差異（P>0.05）。

2.4各組大鼠骨形成標志物水平比較 見表3。

表3可知，模型組OC明顯高于空白對照組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組和戊酸雌二醇組OC低于模型組（P<0.05），骨疏顆粒高劑量組OC高于戊酸雌二醇組（P<0.05）；骨疏顆粒高劑量組OC低于中、低劑量組（P<0.05）；模型組ALP明顯高于空白對照組（P<0.01）；骨疏顆粒高劑量組和戊酸雌二醇組ALP明顯低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組ALP濃度與戊酸雌二醇組無差異（P>0.05）；骨疏顆粒高劑量組ALP濃度低于中、低劑量組（P<0.05）。

2.5各組大鼠骨吸收標志物水平比較 見表4。

表4可知，模型組TRACP明顯高于空白對照組（P<0.01），戊酸雌二醇組和骨疏顆粒高劑量組TRACP均明顯低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組與戊酸雌二醇組組間無差異（P>0.05），骨疏顆粒高劑量組TRACP濃度低于低、中劑量組（P<0.05）；模型組DPD明顯高于空白對照組（P<0.01）；戊酸雌二醇組和骨疏顆粒不同劑量組DPD均低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒不同劑量組與戊酸雌二醇組均能降低DPD水平，戊酸雌二醇優于骨疏顆粒不同劑量組，骨疏顆粒高劑量組DPD濃度低于低、中劑量組（P<0.05）；模型組Ca/Cr明顯高于空白對照組（P<0.01）；戊酸雌二醇組和骨疏顆粒高劑量組Ca/Cr水平明顯低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組與戊酸雌二醇組組間無差異（P>0.05），高劑量組降低Ca/Cr水平優于低、中劑量組（P<0.05）。

3討論

PMOP的發生是由于婦女在絕經后卵巢功能逐漸衰退，體內雌激素水平下降，以進行性骨丟失、骨小梁退行性改變、骨脆性增加及易發生骨折為特征的全身代謝性骨疾病。體內雌激素的缺乏是導致PMOP發生的主要原因。20世紀80年代Gray等首先在體外培養的成骨細胞上發現了ER的存在，雌激素主要通過雌激素受體（ER）來發揮效應。人體的骨代謝是一個動態平衡過程，主要由破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成調控。張健等認為雌激素對骨代謝的調節作用主要通過阻止骨吸收來抑制因絕經引起的骨重建高轉換狀態，達到防治骨丟失、維持骨量的目的。雌激素缺乏還引起的骨吸收亢進，主要是破骨細胞產生過多和靜息態的破骨細胞被激活后活性增強。研究表明當雌激素缺乏時，其促進骨形成的作用效能降低，出現骨形成障礙。在骨代謝過程中會產生一些標志物，這些標志物水平的高低可以評估骨代謝狀況，骨形成標志物有ALP、OC等，骨吸收標志物包括TRACP、DPD、Ca/Cr等。人體在正常情況下血鈣、血磷的濃度呈負相關。當骨質疏松病情較為嚴重時，骨吸收較明顯，血鈣的濃度會升高，而血磷的濃度則下降。本實驗表明，使用骨疏顆粒與戊酸雌二醇治療后血磷水平上升、血鈣水平下降，推測上述2藥能抑制骨吸收，減少骨鈣流向血液；ALP水平與成骨細胞和前成骨細胞活性呈線性關系，具有較高的骨組織特異性，被認為是骨形成標志物。OC是一種由成骨細胞分泌的反映骨轉換率的血清檢測物。本實驗顯示，骨疏顆粒和戊酸雌二醇均降低ALP、OC，說明兩藥能有效促進骨形成；在骨吸收過程中破骨細胞能向血中釋放TRACP，其活性與骨吸收強度相平行。DPD僅存于骨的I型膠原纖維中，當破骨細胞活動時從尿中排出，它的實驗室檢測不受飲食影響。尿鈣/尿肌酐（Ca/Cr）比值也是反映骨吸收的廉價的指標，能夠反映骨吸收水平。本實驗表明2藥均能降TRACP、DPD、Ca/Cr，推測兩藥能減弱骨吸收強度。

總之，本實驗表明骨疏顆粒和戊酸雌二醇均能對骨質疏松大鼠的骨代謝標志物產生影響，具體表現為降低骨形成標志物，增加骨吸收標志物，其作用強度與骨疏顆粒的藥物濃度有正相關趨勢。結合既往的實驗研究推測，骨疏顆粒與雌激素有相似的作用機制，都是通過調控成骨細胞和破骨細胞的活性發揮發揮抗骨質疏松作用的。

（收稿日期：2016-12-20）