共軛亞油酸-精氨酸的制備及其抗氧化活性研究

蘇 平 劉 蕓 宋思圓 喻良仁

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院， 杭州 310058)

共軛亞油酸-精氨酸的制備及其抗氧化活性研究

蘇 平 劉 蕓 宋思圓 喻良仁

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院， 杭州 310058)

等摩爾的共軛亞油酸(CLA)和精氨酸(Arg)通過溶解、混合、濃縮和冷凍干燥等步驟制得水溶性的共軛亞油酸-精氨酸(CLA-Arg)復合物，探究了CLA-Arg復合物對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和對卵黃脂蛋白過氧化的抑制作用，并通過Rancimat法測定不同抗氧化劑對大豆油氧化誘導時間的影響。結果表明：CLA-Arg復合物對DPPH自由基(IC502.76 mg/mL)和ABTS自由基(IC501.43 mg/mL)均有良好的清除效果；在濃度為1.0 mg/mL時，其對卵黃脂蛋白過氧化體系的抑制率達到41.8%；在添加量為0.1%時，使得氧化誘導時間延長到1.79 h且高于BHT，從而CLA-Arg具有良好的抗氧化活性。

水溶性 共軛亞油酸-精氨酸 自由基 抗氧化活性

黃秋葵又名秋葵、補腎草、洋辣椒等，屬錦葵科秋葵屬一年生草本植物，種子中富含多種脂肪酸，如亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等，豐富的亞油酸可以轉化形成具有多種功能活性的共軛亞油酸。共軛亞油酸是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸，與亞油酸形成位置和構象上的異構體，具有生物學活性的2種異構體為9c，11t-CLA和10t，12c-CLA。大量人體及動物學試驗表明，CLA具有降脂[1]、抗氧化[2]、抗癌[3]、提高免疫力、抗動脈粥樣硬化[4]、增加肌肉等生理活性，被譽為“21世紀的新型營養素”。

CLA作為一種功能性因子，因其水不溶性在食品行業的應用受到極大限制，因此提高其水溶性和穩定性具有重要的實踐意義[5]。精氨酸是一種水溶性氨基酸，作為NO的前體，在治療心血管疾病以及免疫調節方面發揮重要作用，同時精氨酸是嬰幼兒的必需氨基酸，作為一種營養增補劑在營養代謝與調控中發揮積極作用[6-7]。因此，將共軛亞油酸與精氨酸結合形成水溶性復合鹽，穩定性得到加強的同時既能夠增加精氨酸的攝入又能夠拓寬CLA在食品及醫藥領域的應用。本研究以等摩爾的CLA和Arg通過溶解、混合、濃縮和凍干等步驟制得水溶性CLA-Arg復合鹽，并通過4種體系探究了其抗氧化活性，分別為對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和對卵黃脂蛋白過氧化的抑制作用以及通過Rancimat法測定不同抗氧化劑對大豆油氧化誘導時間的影響，旨在為CLA-Arg的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共軛亞油酸(來自黃秋葵籽，純度75%)；大豆油：市售；精氨酸、BHT、DPPH、ABTS、卵黃脂蛋白、硫代巴比妥酸：阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、醋酸鈉、醋酸、過二硫酸鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；743 Rancimat油脂氧化穩定性測量儀：瑞士Metrohm公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃秋葵種子中共軛亞油酸的制備

以黃秋葵種子為原料，石油醚為浸提劑，置于超聲波清洗器中反應30 min，抽濾除去濾渣，將混合油置于旋轉蒸發器中回收石油醚，收集母液即得到黃秋葵籽油。后以籽油為原料，KOH為催化劑，丙二醇為溶劑，于180 ℃的油浴鍋內反應3 h，籽油中的亞油酸成功轉化為共軛亞油酸，采用尿素包合法純化不飽和脂肪酸，經測定共軛亞油酸純度達到75%。

1.3.2 共軛亞油酸-精氨酸復合物的制備

參照Kim等[8]方法，適當修改。取10 g精氨酸溶解于60 mL蒸餾水中，16 g共軛亞油酸溶解于100 mL 95%乙醇中，將共軛亞油酸溶液以100 g/min的速率加入到精氨酸溶液中，同時置于磁力攪拌器上攪拌直至混合溶液變得澄清透明。將得到的透明液體于45 ℃旋轉蒸發，除去乙醇，余下水溶液于凍干機中冷凍干燥，即得共軛亞油酸-精氨酸復合物粉末。

1.3.3 DPPH自由基的清除能力

參考Lai等[9]方法，略有修改。準確稱取9.85 mg DPPH用無水乙醇定容到250 mL，獲得0.1 mmol/L的DPPH溶液于4 ℃冰箱中避光保存備用。分別取0.5 mL不同濃度的樣品與4.5 mL DPPH溶液于10 mL試管中振蕩搖勻，常溫避光反應60 min后在517 nm處測定吸光值，每個樣品測定3次，按照下式計算清除率。

式中：A0為DPPH溶液+無水乙醇的吸光值；A1為DPPH溶液+樣品稀釋液的吸光值；A2為無水乙醇+樣品稀釋液的吸光值。

1.3.4 ABTS自由基的清除能力

參考Arnao等[10]方法，略有修改。用pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液配制7 mmol/L的ABTS儲備液，ABTS儲備液和2.45 mmol/L的過二硫酸鉀等體積反應產生ABTS+，此溶液需在室溫黑暗處放置12～16 h后使用。穩定后的ATBS+溶液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02，取4.9 mL該溶液與0.1 mL樣品稀釋液充分混勻后，避光放置5 min，在734 nm處測定吸光值，每個樣品測定3次，按照公式計算清除率。

式中：A0為ATBS+溶液+無水乙醇的吸光值；A1為ATBS+溶液+樣品稀釋液的吸光值；A2為無水乙醇+樣品稀釋液的吸光值。

1.3.5 卵黃脂蛋白過氧化的抑制能力

參考張爾賢等[11]方法，略有修改。用0.1 mol/L pH為7.4的磷酸鹽緩沖液配制體積分數3.85%的卵黃懸浮液，0.4 mL的卵黃懸浮液分別與0.1 mL不同濃度的樣品稀釋液反應，同時以CLA、Arg、BHT為陽性對照，無水乙醇為空白對照，再加入0.4 mL濃度為25 mmol/L的硫酸亞鐵，用1.0 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液補充至4 mL，37 ℃恒溫振蕩15 min，取出后分別加入1 mL質量分數20%的三氯乙酸，吸取上清液4 mL于試管中，加入質量分數0.28%硫代巴比妥酸溶液2 mL，加塞，沸水浴15 min，冷卻后于波長532 nm處測定吸光值，每個樣品測定3次，按照公式計算抑制率。

式中：A0為空白對照組的吸光值；A1為樣品組的吸光值。

1.3.6 Rancimat法對氧化誘導時間的影響

參考Cordeiro等[12]方法，略有修改。準確稱取大豆油3.00 g置于樣品管中，分別加入不同濃度的樣品稀釋液，以CLA、Arg、BHT為陽性對照，乙醇為空白對照，油脂氧化穩定性測定儀恒定溫度為131 ℃，空氣流速為20 L/h，測定不同組的氧化誘導時間，時間越長，說明氧化穩定性越好。

1.3.7 數據處理

采用Microsoft Excel軟件對數據進行整理，Origin 8.5 軟件作圖以及SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基的清除能力

DPPH在乙醇溶液中形成一種穩定的自由基，呈現深紫色，在517 nm處有特征吸收。當有抗氧化劑存在時，其提供的氫原子與DPPH自由基的孤對電子配對，生成無色物質，從而吸光值降低[9，13]。由圖1可知，相同濃度下，CLA-Arg對DPPH自由基的清除率明顯高于Arg，同時CLA對DPPH自由基的清除作用較弱[2]，表明Arg和CLA存在協同抗氧化作用，使得Arg-CLA的抗氧化活性得到增強。在一定濃度范圍內，BHT、CLA-Arg和Arg對DPPH自由基的抑制率與濃度成正相關，BHT對DPPH自由基的抑制率明顯高于CLA-Arg和Arg，其中BHT的IC50值為0.201 mg/mL，CLA-Arg的IC50值為2.76mg/mL，CLA-Arg對DPPH自由基的抗氧化效果約為BHT的十分之一，具有較好的DPPH自由基清除能力。

圖1 不同濃度CLA-Arg、Arg、BHT對DPPH自由基的清除

2.2 ABTS自由基的清除能力

ABTS自由基能夠與抗氧化劑提供的電子迅速反應，使其穩定的藍綠色發生褪色，此變化可用734 nm 處吸光度的變化來評價。由于ABTS自由基能夠同時與親水性或親脂性抗氧化劑反應，并且其pH值的適用范圍較廣，因此ATBS法作為一種簡單、快速、可靠的抗氧化評價方法得到廣泛應用[14]。由圖2可知，在一定濃度范圍內，BHT、CLA-Arg和Arg對ABTS自由基的抑制率與濃度成正相關，BHT對ABTS自由基的抑制率明顯高于CLA-Arg和Arg，CLA-Arg對ABTS自由基的抑制率略高于Arg，其中BHT的IC50值為0.102 mg/mL，CLA-Arg的IC50值為1.43 mg/mL，表明CLA-Arg對ABTS自由基的抗氧化效果約為BHT的十分之一，具有良好的ABTS自由基清除能力。由圖1和圖2可知，CLA-Arg清除DPPH自由基的IC50值為2.76 mg/mL，清除ABTS自由基的IC50值為1.43 mg/mL，說明CLA-Arg對ABTS自由基的清除能力高于DPPH，這主要是由于ABTS自由基能夠溶于水相和有機相，而DPPH自由基只能夠溶于有機相，所以ABTS自由基的敏感性要比DPPH強。

圖2 不同濃度CLA-Arg、Arg、BHT對ABTS自由基的清除

2.3 卵黃脂蛋白過氧化的抑制能力

卵黃脂蛋白富含多不飽和脂肪酸，在Fe2+的催化下可以引起脂質過氧化反應，據報道很多疾病和細胞衰老現象都與細胞膜上的脂質過氧化有關。本試驗以卵黃脂蛋白溶液為脂質過氧化體系，通過測定吸光度的變化來評價各抗氧化劑對脂質過氧化的抑制能力。由圖3可知，CLA-Arg在0.2～1.0mg/mL范圍內，對卵黃脂蛋白的過氧化抑制率隨濃度的增加而增大；在0.2 mg/mL下，CLA-Arg對過氧化體系的抑制率高于單獨的CLA和Arg，顯著低于人工合成抗氧化劑BHT，但在1.0 mg/mL時，CLA-Arg對過氧化體系的抑制率達到41.8%，約為BHT抑制率的一半，可見高濃度的CLA-Arg對Fe2+誘發的卵黃脂蛋白過氧化體系有較好的抑制效果。

注：1為0.2 mg/mL CLA-Arg，2為0.4 mg/mL CLA-Arg，3為0.6 mg/mL CLA-Arg，4為0.8 mg/mL CLA-Arg，5為1.0 mg/mL CLA-Arg，6為0.2 mg/mL CLA，7為0.2 mg/mL Arg，8為0.2 mg/mL BHT。圖3 不同抗氧化劑對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制效果

2.4 Rancimat法對氧化誘導時間的影響

油脂樣品在恒定溫度下通入干燥空氣，不飽和脂肪酸會被氧化成小分子易揮發的酸，進而被空氣帶入盛有蒸餾水的電導率測量管中，監測并記錄電導率對反應時間的氧化曲線，從而得到樣品的氧化誘導時間。抗氧化劑的加入可以延緩油脂氧化酸敗，延長誘導時間[15]。由圖4可知，加入不同抗氧化劑組的氧化誘導時間均比空白組長，在CLA-Arg的添加量從0.04%增加到0.10%的過程中，油脂氧化誘導時間隨添加量的增大而增加。當添加量為0.04%時，CLA-Arg組的氧化誘導時間長于單獨的CLA和Arg組，表明Arg和CLA存在協同抗氧化作用；當CLA-Arg添加量為0.1%時，其氧化誘導時間延長到1.79 h，遠高于0.02%BHT添加組，低于0.02%TBHQ添加組，表明CLA-Arg的加入能夠一定程度上延緩油脂氧化，延長誘導時間。

注：1為空白，2為0.04% CLA-Arg，3為0.06% CLA-Arg，4為0.08% CLA-Arg，5為0.10% CLA-Arg，6為0.04% CLA，7為0.04% Arg，8為0.02% BHT，9為0.02% TBHQ。圖4 不同抗氧化劑對大豆油的抗氧化效果

3 結論

結果表明，CLA-Arg對DPPH、ABTS自由基的清除以及脂質過氧化的抑制和氧化誘導時間的影響均隨著濃度的增大其效果增強，CLA-Arg對DPPH、ABTS自由基的清除能力約為BHT清除能力的十分之一；當CLA-Arg為1.0 mg/mL時，其對脂質過氧化體系的抑制率達到41.8%，約為0.2 mg/mL BHT抑制率的一半；CLA-Arg添加量為0.1%時，其延緩油脂氧化的能力要高于0.02%BHT添加組，但低于0.02%TBHQ添加組。CLA-Arg 的抗氧化能力明顯高于單獨的Arg和CLA，這說明Arg和CLA對CLA-Arg復合物的抗氧化性具有協同促進的作用，很可能的一個原因就是CLA羧基端Arg的存在能夠有效地保護氧化攻擊，同時精氨酸的親水基團增強了親水體系中CLA的抗氧化性。

水溶性CLA-Arg復合物能夠極大地拓寬其在保健食品以及醫藥等領域中的應用范圍，并在一定程度上通過清除自由基、抑制脂質過氧化以及延緩油脂的氧化等多種途徑發揮其抗氧化活性，是一種潛在的抗氧化劑資源。

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Preparation and Antioxidant Activity of Conjugated Linoleic Acid-Arginine Complex

Su Ping Liu Yun Song Siyuan Yu Liangren

(College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058)

Water-soluble conjugated linoleic acid-arginine (CLA-Arg) complex had been prepared by dissolving, mixing, concentration and freeze drying from same mole of CLA and Arg. The antioxidant activity of CLA-Arg was studied by measuring its scavenging effects on DPPH radical and ABTS radical, inhibition effect on liposome peroxide and influence on oxidation induction time by Rancimat. The results showed that CLA-Arg had strong scavenging capacity on DPPH radical (IC502.76 mg/mL) and ABTS radical (IC501.43 mg/mL); the inhibition rate of liposome peroxide system was 41.8% when the concentration was 1.0 mg/mL; the oxidation induction time extended to 1.79 h and was higher than BHT when the content was 0.1%. CLA-Arg had a significant antioxidant activity.

water-soluble, conjugated linoleic acid-arginine (CLA-Arg), free radical, antioxidant activity

2015-10-28

蘇平，男，1962年出生，副教授，果蔬加工

劉蕓，女，1989年出生，碩士，食品科學與工程

TS229

A

1003-0174(2017)06-0074-05