超聲輔助美拉德反應提高大豆蛋白凍融性質

張澤宇 張詩雨 于 潔 王喜波 江連洲 徐 日

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

超聲輔助美拉德反應提高大豆蛋白凍融性質

張澤宇 張詩雨 于 潔 王喜波 江連洲 徐 日

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

為了提高大豆蛋白的凍融性質，試驗采用超聲輔助美拉德反應的方法改性大豆蛋白，以改性產物的乳化性質和乳析指數為考核指標，研究大豆分離蛋白與葡聚糖(SPI∶D)質量比、反應溫度、超聲功率、反應時間對改性產物凍融性質的影響。結果表明，SPI∶D為2∶3、反應溫度80 ℃、超聲功率500 W、反應時間40 min時，改性產物凍融穩定性較好，SPI-D接枝物與對照SPI相比，乳化活性和乳化穩定性分別提高了39.89%和43.80%，經1、2、3次凍融循環后乳析指數分別降低了57.76%、75.33%、96.20%，在1、2、3次凍融循環后乳液粒徑分別降低了34.04%、42.12%、126.9%。

超聲波 大豆分離蛋白 乳化性 乳析指數 粒徑

大豆蛋白因具有較高營養價值和良好的功能特性在食品工業中廣泛應用。大豆蛋白具有表面活性，在食品體系中常被用作乳化劑[1]。許多食品在生產加工及貯存過程中都要經過冷凍-解凍處理，例如冰激淋、植物奶油、蛋黃醬等。蛋白質作為乳化劑制備的乳液在進行冷凍時，隨著溫度的降低，水相形成冰晶體，體積膨脹，介質被濃縮，當達到飽和狀態時，產生沉淀。冰晶體的增多，間隙中的乳液粒子被擠壓形成聚結體，當乳液融化時，很難恢復成原來的分散狀態，進而表現出絮凝、聚結、乳析、奧氏熟化，最終導致油相水相分離，乳液凍融穩定性較差[2-4]。

孫煒煒[5]利用干法糖基化反應得到乳清分離蛋白-葡聚糖共價復合物，將其作為乳化劑制備的乳液經過凍融循環處理后，粒徑無明顯增加，沒有出現脂肪上浮、絮凝、聚結等不穩定現象。Xu等[6]采用乳清分離蛋白和葡聚糖通過干法制備接枝產物Ⅰ(80 ℃，2 h)和產物Ⅱ(60 ℃，5 d)，結果發現糖基化產物Ⅱ由于接枝程度高，比產物Ⅰ的凍融穩定性好。孫洪蕊等[7-8]通過濕法糖基化得到的大豆分離蛋白-葡聚糖接枝物凍融前后乳化性顯著提高。竇超然等[9]發現大豆分離蛋白與麥芽糊精濕法接枝物凍融后分層系數和出油率顯著降低。在前面學者研究的基礎上本試驗采用超聲輔助美拉德反應進一步改善大豆蛋白的凍融性質，加快反應速率，縮短反應時間。以乳化性和1、2、3次凍融循環后乳析指數為評價指標，研究制備高凍融穩定性的大豆分離蛋白,以期為其在冷凍食品行業的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粉：哈高科大豆食品有限責任公司；大豆分離蛋白(蛋白質質量分數90.45%)：堿溶酸沉法自制；葡聚糖4萬：國藥集團化學試劑有限公司；大豆油：九三集團哈爾濱惠康食品有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)：Biotopped公司。

1.2 主要儀器

ALPHA 1-4 LSC冷凍干燥機：德國Christ公司；XH-2008D超聲波合成萃取儀(探頭直徑：8 mm，超聲波頻率：25 kHz)：北京祥鵠科技發展有限公司；T18 Basic高速分散機：德國IKA公司；TU-1800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀：英國Malvern公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲SPI-D的制備

將大豆分離蛋白與葡聚糖按一定比例(2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3)溶解于0.01 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液，配成蛋白質量濃度為40 mg/mL的溶液，室溫下攪拌2 h后置于4 ℃冰箱中過夜。取出平衡至室溫，取蛋白樣品溶液100 mL置于超聲反應器中，預熱到超聲波合成萃取儀設定的溫度(70、75、80、85、90 ℃)，以一定功率(200、300、400、500、600 W)處理一定時間(20、30、40、50、60 min)，冰水浴冷卻5 min使反應停止。反應液在4 000 r/min下離心10 min，上清液即為超聲SPI-D接枝物，于蒸餾水中透析24 h，冷凍干燥制成凍干粉。

1.3.2 乳化性測定

將凍干蛋白樣品溶解于0.2 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，蛋白質量濃度為2 mg/mL。蛋白溶液與大豆油按體積比3∶1混合，11 000 r/min均質1 min形成乳化液，分別在均質后0和10 min時，在混合液底部取100 μL加入到10 mL 0.1% SDS溶液中，混合均勻于500 nm處測定吸光值[10]，以0.1% SDS溶液為空白。乳化活性(EAI)表示為：

式中：EAI是每克蛋白質的乳化面積/m2/g；T=2.303；N是稀釋倍數100；φ是體系中油相所占體積分數0.25；C是蛋白質的濃度/g/mL；L是比色池光徑1 cm。

乳化穩定性(ESI)表示為：

式中：A0為0 min時的吸光值；A10為10 min時的吸光值；ΔT為時間差10 min。

1.3.3 乳液制備

將凍干蛋白樣品溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，蛋白質量濃度為20 mg/mL。蛋白溶液與大豆油按體積比9∶1混合，11 000 r/min均質3 min形成粗乳液，再超聲處理6 min，形成微乳液[11-12]。

1.3.4 乳析指數測定

參考Taherian等[13]的方法，新鮮制備的乳液立即轉移到10 mL塑料管內，在-18 ℃冷凍保存22 h，取出后20 ℃水浴解凍2 h，連續進行3次凍融循環。用刻度尺測量底部乳清層高度和乳液總高度，按下式計算乳液1、2、3次凍融循環后的乳析指數。

式中：HS表示乳清層高度/cm；HT表示乳液總高度/cm。

1.3.5 粒徑測定

將乳液分散在1 000 mL去離子水中使遮光率超過10%，設定顆粒折射率為1.460，分散劑折射率為1.330，采用激光粒度分析儀測定0、1、2、3次凍融循環后乳液的體積平均粒徑。

1.4 統計分析

所有試驗重復3次，結果以均值±標準偏差表示，采用Origin 9軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 SPI與葡聚糖的質量比對超聲SPI-D凍融穩定性的影響

在反應溫度80 ℃，超聲功率400 W，反應時間30 min下，研究不同SPI∶D質量比對超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環后乳析指數的影響。

圖1 SPI:D質量比對超聲SPI-D乳化性的影響

圖2 SPI:D質量比對超聲SPI-D乳析指數的影響

由圖1可知，隨著葡聚糖添加量的增加，超聲SPI-D乳化性呈現逐漸增加趨勢，乳化活性在1∶1時最大，乳化穩定性在2∶3時最大，二者達到最大值后略有下降。SPI制備的乳液在凍融過程中脂肪球與連續相之間出現密度差，脂肪球上浮，發生乳析現象。從圖2可以看出，SPI乳液凍融循環后乳析指數急劇增大，而超聲SPI-D乳液在1、2、3次凍融循環后乳析指數有了很大程度的降低。隨著糖添加比例的增加乳析指數逐漸下降，在2∶3時最小，后來增加不明顯。在超聲波作用下大豆蛋白球狀分子展開，疏水基團不斷暴露，糖分子與蛋白質分子碰撞機會增多，糖鏈不斷接入到蛋白質分子中，增加了蛋白質的溶解性[14]，同時多糖還有增稠作用，增加乳液中未冷凍的水的量和水相的黏度，使油滴運動變慢，降低油滴聚結現象的發生[15]，因而改性產物凍融穩定性和乳化性顯著增加。當葡聚糖含量繼續增加，反應體系黏度過大，分子流動性差，不利于美拉德反應進行[16]。綜合考慮其乳化性和乳析指數以及葡聚糖成本問題，選取SPI與葡聚糖的質量比為2∶3進行后續試驗。孫洪蕊等[7]和竇超然等[9]優化得到蛋白質與葡聚糖質量比分別為1∶3和1∶2，與之相比本試驗糖的添加量減少了，降低了成本。

2.2 反應溫度對超聲SPI-D凍融穩定性的影響

在SPI∶D質量比2∶3，超聲功率400 W，反應時間30 min下，研究不同反應溫度對超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環后乳析指數的影響。

從圖3中可以看出，超聲SPI-D的乳化穩定性隨著溫度的增加呈現出先升高后下降的趨勢，在溫度為80 ℃時最大，超過該溫度后急劇下降。而在75～85 ℃間乳化活性增加不是很顯著，當溫度增大到90 ℃時下降明顯。由圖4可知，在反應溫度80 ℃

圖3 反應溫度對超聲SPI-D乳化性的影響

圖4 反應溫度對超聲SPI-D乳析指數的影響

時乳析指數最低，當溫度繼續增加時其乳析指數又顯著增大。在一定范圍內隨溫度升高，SPI分子結構展開，柔韌性增加，與葡聚糖美拉德反應速度加快，改性產物親水性增大從而導致乳化性和凍融穩定性提高。當反應溫度繼續升高到85 ℃時，蛋白質嚴重變性，結構發生很大變化，改性產物界面活性降低，同時也由于過多的糖鏈引入而失去油水平衡[17]，乳化性和凍融穩定性下降，這與Wu等[18]得到的結果一致。綜合考慮乳化性和乳析指數，選取反應溫度為80 ℃進行后續試驗。孫洪蕊等[7]和竇超然等[9]最佳反應溫度分別為95和90 ℃。與二者相比，本試驗在超聲波輔助下糖基化反應溫度降低到80 ℃。

2.3 超聲功率對超聲SPI-D凍融穩定性的影響

在SPI∶D質量比2∶3，反應溫度80 ℃，反應時間30 min下，研究不同超聲功率對超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環后乳析指數的影響。

由圖5可知，在200～500 W范圍內隨著超聲功率的增加超聲SPI-D乳化性呈直線增加的趨勢，當超過500 W后出現降低。圖6中乳析指數隨超聲功率的增大而逐漸減少。SPI乳化性和凍融穩定性與大豆分離蛋白結構變化存在著密切關系。超聲的空化效應和機械震蕩效應破壞了蛋白質分子的四級結構，釋放出小分子的亞基和肽[19]，SPI分子中的α-螺旋和β-折疊明顯減少，向無規則卷曲進行轉變，SPI分子結構越來越疏松，游離氨基含量不斷增加，蛋白分子與糖分子間相互碰撞次數增多，加快接枝反應進行[20]，接枝后蛋白質快速吸附到油水界面，形成一層蛋白保護膜，使其可以降低冷凍時產生的冰晶體對乳液造成的破壞，減緩液滴相互聚集而發生乳析現象[21]，從而乳化性和凍融穩定性有了很大程度的提高。當功率達到600 W時，由于功率過高會使蛋白發生聚集，體系中不溶性組分顯著增多，乳化活性和乳化穩定性均降低，但乳析指數變化不大，500 W時超聲SPI-D乳液在油水界面形已形成穩定的二相體系，進一步增加功率對其凍融穩定性影響不大。綜合考慮應選取500 W進行后續試驗。

圖5 超聲功率對超聲SPI-D乳化性的影響

圖6 超聲功率對超聲SPI-D乳析指數的影響

2.4 反應時間對超聲SPI-D凍融穩定性的影響

在SPI∶D質量比2∶3，反應溫度80 ℃，超聲功率500 W下，研究不同反應時間對超聲SPI-D乳化性和1、2、3次凍融循環后乳析指數的影響。

圖7 反應時間對超聲SPI-D乳化性的影響

由圖7可知，對前面3個因素優化的基礎上，反應時間增加到40 min后，繼續延長時間改性產物乳化活性和乳化穩定性變化不明顯。在40 min時乳化活性最大，乳化穩定性在50 min時最大。由圖8可知，超聲SPI-D制備的乳液凍融后乳析指數隨反應時間的延長先降低后升高，在40 min時乳析指數最小。綜合考慮選取40 min為最佳反應時間。孫煒煒[5]研究乳清分離蛋白與葡聚糖接枝物凍融穩定性時，采用干法美拉德反應，需要時間一周左右。孫洪蕊等[7]在濕法美拉德反應提高大豆蛋白凍融前后乳化性中優化出最佳時間4 h。竇超然等[9]研究大豆分離蛋白與麥芽糊精濕法糖基化反應，以分層系數和出油率為指標，最優時間為3 h。本試驗在超聲波輔助作用下進行美拉德反應，大豆分離蛋白凍融穩定性顯著提高，同時反應時間縮短至40 min，提高了反應效率。

圖8 反應時間對超聲SPI-D乳析指數的影響

2.5 單因素相關性分析

在單因素試驗基礎上，運用SPSS19.0軟件對4個因素與乳化活性、乳化穩定性和乳析指數間的相關性進行了分析，為下一步優化試驗做準備。相關性用Pearson相關系數表示，用*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01)。由表1可知，對乳化活性影響較大的因素為超聲功率和反應時間，而乳化穩定性影響較大的為SPI∶D質量比、超聲功率和反應時間。超聲功率對乳析指數高度負相關，反應溫度對其正相關。

表1 4個因素與指標間相關性分析

2.6 不同樣品凍融穩定性

根據單因素的試驗結果，較優的試驗組合條件為：SPI∶D質量比2∶3、反應溫度80 ℃、超聲功率500 W、反應時間40 min。在此條件下進行3次驗證試驗，同時設定SPI、SPI+D混合物(SPI與葡聚糖按質量比2∶3混合溶于磷酸鹽緩沖液，再冷凍干燥制成凍干粉)2個對照組。乳化性和乳析指數結果如表2所示。粒度分布是影響乳析的主要因素，乳析指數與粒徑呈正相關，粒徑越大，上浮速度越快，乳析指數也越大[22]。不同樣品凍融循環后粒徑見表3。

加入葡聚糖后SPI乳化性略有提高，超聲SPI-D改性產物與SPI相比乳化活性和乳化穩定性分別提高了39.89%、43.80%。2個對照組隨凍融循環次數的增加乳析指數急劇增加，超聲SPI-D隨著凍融循環次數的增加乳析指數增幅不大，與SPI對照組相比在1、2、3次凍融循環后乳析指數分別降低了57.76%、75.33%、96.20%。制備的新鮮乳液粒徑大小順序為超聲SPI-D>SPI+D混合物>SPI。隨著凍融循環次數的增加，SPI、SPI+D混合物乳液的粒徑增加顯著，且SPI乳液的增加幅度大于SPI+D混合物，葡聚糖的加入在一定程度上減緩了粒徑的增加。而超聲SPI-D制備的乳液在經歷冷凍-解凍循環后，粒徑變化不明顯。與SPI對照組相比，超聲SPI-D在1、2、3次凍融循環后乳液粒徑分別降低了34.04%、42.12%、126.9%，和乳析指數結果一致。說明通過超聲波輔助大豆分離蛋白與葡聚糖進行美拉德反應來提高其凍融穩定性的方法是可行的。

表2 不同樣品乳化性和凍融循環后乳析指數

表3 不同樣品凍融循環后粒徑

3 結論

利用超聲波輔助美拉德反應技術能有效提高大豆分離蛋白的凍融穩定性，并縮短改性時間、提高改性效率、節省了能源、降低了成本，為冷凍食品專用大豆蛋白的產業化開發提供新思路和技術依據。

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Improving Freeze-Thaw Stability of SPI by Uultrasonic-Glycosylation

Zhang Zeyu Zhang Shiyu Yu Jie Wang Xibo Jiang Lianzhou Xu Ri

(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Haerbin 150030)

In order to improve the freeze-thaw stability of soybean protein isolate, the soybean protein isolate was modified by ultrasonic assisted wet glycosylation, emulsifying properties and creaming index as evaluation indexes to study the mass ratio of SPI to dextran (SPI∶D), reaction temperature, ultrasonic power, reaction time on the freeze-thaw stability of glycosylation products. Results showed that under the condition of SPI∶D ratio 2∶3, reaction temperature 80 ℃, ultrasonic power 500 W, reaction time 40 min, the freeze-thaw stability of glycosylation products attained the optimal level. Compared with the control SPI, the emulsifying activity index and emulsifying stability index increased by 39.89% and 43.80%, the creaming index decreased by 57.76%, 75.33% and 75.33%, and the particle size of emulsions decreased by 34.04%, 42.12%, 126.9% after the first, second and third time of freeze-thaw cycle.

ultrasonic wave, soybean protein isolate, emulsifying properties, creaming index, particle size

黑龍江省應用技術研究與開發計劃(WB13C10201)，國家大豆產業技術體系項目(CARS-04-PS25)，“十二五”國家科技支撐計劃(2014BAD22B01)

2015-12-30

張澤宇，男，1991年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

王喜波，男，1975年出生，副教授，糧食、油脂及植物蛋白工程

TS201.2

A

1003-0174(2017)06-0063-06