無機鹽對小麥胚芽脂肪酶結構和活性的影響

陳中偉 王可可 劉艷霞 徐 斌

(江蘇大學食品與生物工程學院；農產品加工工程研究院，鎮江 212013)

無機鹽對小麥胚芽脂肪酶結構和活性的影響

陳中偉 王可可 劉艷霞 徐 斌

(江蘇大學食品與生物工程學院；農產品加工工程研究院，鎮江 212013)

為探索一種新型的小麥胚芽穩定化方法，采用圓二色譜和熒光光譜對無機鹽處理后的商品化麥胚脂肪酶的結構進行了研究，同時，考察了不同無機鹽對麥胚中脂肪酶活力及麥胚酸價的影響。結果表明，當NaCl濃度為4×10-9mol/L時，對商品化麥胚脂肪酶的抑制效果最好，其活力降低了21.8%，而KCl對脂肪酶的活力無顯著影響，CaCl2和MgCl2均對脂肪酶有激活作用；所選無機鹽對脂肪酶二級結構均無明顯影響，但NaCl對脂肪酶的三級結構有一定影響；當添加無機鹽后，麥胚中的脂肪酶活力和麥胚的酸價均低于未添加無機鹽的麥胚，其中1.30%NaCl使脂肪酶活力降低了62.49%，0.75% KCl使脂肪酶活力降低了61.27%。由以上結果可知，添加無機鹽可作為有效抑制脂肪酶的活力的手段，利于延長麥胚的貯藏期。

麥胚 脂肪酶 無機鹽 蛋白結構 酶活

麥胚是小麥籽粒中營養最豐富的部分之一，富含脂肪、蛋白、礦物質和維生素。但由于其含有高活性脂肪酶與不飽和脂肪酸，極易酸敗變質，致使麥胚易風味惡化、酸度上升、營養品質下降[1-2]，嚴重影響麥胚的精深加工與高效利用。針對這一難題，眾多研究者曾采用熱風干燥、濕熱蒸汽等熱處理方式鈍化麥胚脂肪酶，由于脂肪酶具有較好的熱穩定性，熱處理鈍酶不徹底；同時，熱處理可能引發脂質自動氧化從而引起非酶酸敗，降低麥胚的營養價值[3-4]。目前，穩定麥胚的另一種思路是向麥胚中添加脂肪酶抑制劑，其中無機鹽作為脂肪酶抑制劑受到眾多研究者的青睞[5]。

酶的催化活性與酶結構密切相關，研究無機鹽對脂肪酶結構的影響具有重要意義[6]，已有研究證實，無機鹽對酶活性的抑制作用是由于無機鹽改變了酶的結構造成的[7]。Müller等[8]首次證明了KCl對死海鹽盒菌脂肪酶結構的影響。Cheng等[9]研究了CaCl2對銅綠假單胞菌脂肪酶結構的影響，發現Ca2+會改變脂肪酶活性中心精氨酸153和天冬氨酸157殘基的電荷，影響活性中心“蓋子”的打開與關閉，使脂肪酶由活性構象轉變為非活性構象，降低了脂肪酶的活性。目前，關于無機鹽對脂肪酶結構影響的研究，多是針對微生物來源的脂肪酶，無機鹽對麥胚脂肪酶結構和活性的影響鮮見報道。本研究探討了不同種類無機鹽對商品化麥胚源脂肪酶活力與結構的影響，并在此基礎上，分析了無機鹽對麥胚中脂肪酶活力以及麥胚酸價的影響，以及無機鹽鈍化麥胚脂肪酶的可行性，為麥胚穩定化處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥胚芽脂肪酶(5～15 U/mg蛋白)：美國Sigma公司；三乙酸甘油酯：梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；小麥胚芽：新疆天山面粉公司；橄欖油：西班牙muelolivas橄欖油公司。

1.2 儀器與設備

S220精密pH計：瑞士Mettler Toledo公司；877 Titrino plus自動電位滴儀：瑞士Metrohm公司；J-815圓二色光譜儀：日本JASCO公司；Cary Eclipse熒光分光光度計、Cary紫外-可見分光光度計：美國Varian公司；HB43-S型鹵素水分快速測定儀：瑞士Mettler Toledo公司；Aqua Lab Series 3水分活度儀：美國Decagon Devices公司；RE-52A型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 無機鹽對商品化麥胚脂肪酶的活力及結構的影響

1.3.1.1 樣品預處理

稱取500.0 mg商品化麥胚脂肪酶溶于0.1mol/L pH=7.7的Tris-HCl緩沖液，定容至50 mL，配成濃度為10 mg/mL的酶溶液，然后在25 ℃、8 000r/min的條件下離心20 min，取上清液作為脂肪酶貯備液保存于冰箱中。

移取2 mL的10 mg/mL的脂肪酶貯備溶液，加入一定濃度的無機鹽標準溶液(用0.1 mol/L pH=7.7的Tris-HCl緩沖液配制不同濃度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2標準溶液)，用0.1 mol/L pH 7.7的Tris-HCl緩沖液定容至10 mL，配成質量濃度為2 mg/mL的無機鹽—脂肪酶混合溶液。搖勻后放入25 ℃恒溫振蕩器振蕩20 min，待測。

1.3.1.2 脂肪酶活力測定

參考徐斌等[10]的方法。移取10 mL 0.33 mol/L的三乙酸甘油酯底物溶液(三乙酸甘油酯溶于0.1 mol/L pH=7.7的Tris-HCl緩沖溶液)于25 mL具塞三角錐形瓶中，添加2 mL無機鹽—脂肪酶混合溶液；空白組添加2 mL 0.1 mol/L pH 7.7的Tris-HCl緩沖液。置于37 ℃烘箱中反應4 h，反應結束后，將樣品置于沸水浴中10 min終止反應，再用冷水冷卻樣品至室溫，進行脂肪酶活力的測定。用0.005 mol/L的H2SO4溶液滴定樣品至pH=6.0，由2管所用滴定液之差(ΔVH2SO4)即可計算出麥胚脂肪酶水解三乙酸甘油酯生成的脂肪酸量。按公式計算脂肪酶的活力：

式中：X為脂肪酶的活力/U/mg；A為滴定樣品時消耗H2SO4標準溶液的體積/mL；B為滴定空白時消耗H2SO4標準溶液的體積/mL；t為反應的時間；m為0.5mL硫酸中所含的氫離子的物質的量/μmol；n為酶液稀釋倍數。

1.3.1.3 脂肪酶的結構測定

用0.1 mol/L pH=7.7的Tris-HCl緩沖溶液將無機鹽-脂肪酶混合溶液稀釋至0.08 mg/mL，進行光譜分析。

圓二色譜(CD)分析脂肪酶二級結構條件：石英樣品池的光程1.0 cm，響應時間0.5 s，掃描速度50 nm/min，帶寬2 nm，靈敏度50 mdeg/cm，掃描測定波長范圍190～250 nm。

熒光發射光譜分析脂肪酶三級結構條件：激發波長λex=279 nm，激發狹縫和發射狹縫均為5 nm，掃描測定波長范圍300～400 nm。

1.3.2 無機鹽對麥胚中脂肪酶鈍化效果

1.3.2.1 麥胚預處理

稱取100 g新鮮麥胚，均勻噴灑10 mL不同濃度無機鹽溶液。根據文獻報道[11]設置無機鹽的添加量(無機鹽添加量均以干基計)。NaCl添加量分別為：0.40%、0.70%、1.00%、1.30%，KCl添加量分別為：0.25%、0.50%、0.75%、1.00%。

1.3.2.2 加速貯藏試驗

將麥胚裝入聚乙烯袋(100 g)，置于40 ℃培養箱貯藏7 d，考察麥胚中脂肪酶活力與酸價的變化。

1.3.2.3 麥胚中脂肪酶活力測定

參考徐斌等[10]的方法。取2支10 mL的離心管，1支是樣品管(Af)，另1支是空白對照管(Ai)。分別將2.0 g脫脂麥胚(干基，30目粉碎)和1.5 mL橄欖油裝入離心管，混勻。樣品管在55 ℃培養箱中反應4 h，用30 mL正己烷分3次萃取反應物，對照管加入30 mL的直接萃取反應物，萃取液減壓濃縮溶于4 mL異辛烷，加入2 mL 5%(m/V)醋酸銅(吡啶調至pH=6.1)，振蕩、離心取上層有機相，715 nm波長條件下測定吸光度，脂肪酶活力以相對酶活表示。

式中：Y為脂肪酶活動度/U/g；1 000為mol/L到μmol/mL的轉換系數；4為重溶油脂的異辛烷的體積/mL；V為加入橄欖油的體積/mL；Af為在715 nm下經過反應的樣品的吸光度；Ai為在715nm下空白樣品的吸光度；ε為油酸在715 nm下的摩爾吸光系數/(mol·L-1·cm)-1；T為反應時間/h；I為路徑長度/cm；s為樣品干質量/g。

1.3.2.4 麥胚酸價測定

麥胚油(石油醚提取)溶解在中性乙醚+乙醇(2∶1，V/V)中，用0.05 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液進行滴定，酚酞作為指示劑。

1.3.3 統計分析

采用SPSS 19.0進行數據分析，用95%置信水平(P<0.05)來說明數據間差異顯著性。每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 無機鹽對脂肪酶活性的影響

由圖1a可知，NaCl對脂肪酶活性有抑制作用，隨著NaCl濃度的增加，脂肪酶活力先減小再增加；NaCl濃度為2×10-9mol/L時，脂肪酶活力最低，酶活力降低了14%；KCl對脂肪酶活性無明顯作用；CaCl2、MgCl2對脂肪酶活性有不同程度的激活作用。

研究了相同濃度下4種無機鹽對脂肪酶活力的影響，得出NaCl對脂肪酶活力影響最大，所以，進一步縮小范圍確定NaCl的最佳濃度。圖1b NaCl在1×10-9～8×10-9mol/L濃度范圍內，對脂肪酶活性有抑制作用，其中NaCl濃度為4×10-9mol/L時，對脂肪酶的抑制效果最好，此時脂肪酶活力降低了21.8%。

脂肪酶是一種具有界面活性的蛋白質，可通過分子間靜電作用吸附在油水界面對甘油三酯進行水解[12-13]，油水界面不僅是脂肪酶反應的場所，也是調控的關鍵位點。已有研究表明，一定濃度NaCl溶液可以降低油水界面的張力，進而改變界面分子的靜電作用影響脂肪酶在油-水界面的吸附，另外甘油三酯水解產生的甘油二酯、游離脂肪酸等均會占據界面層與脂肪酶分子發生競爭，從而影響脂肪酶的水解速率[14]。

圖1 無機鹽對商品化麥胚脂肪酶活性的影響

而CaCl2和MgCl2對脂肪酶的激活作用可能是2個方面原因：一方面，CaCl2和MgCl2能夠與水解后的脂肪酸結合成不溶復合物脂肪酸鈣鹽，消除了產物的抑制作用[15]；另一方面，可能是由于Ca2+或Mg2+會與脂肪酶催化中心帶有負電的Ser-His-Asp“催化三聯體”交聯，使得脂肪酶的剛性增加，結構更加穩定[16-17]。

2.2 無機鹽對脂肪酶二級結構影響

由圖2可知，不同濃度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2對脂肪酶的CD光譜均無顯著影響，在208和222 nm處α-螺旋的負峰、215 nm處β-折疊的負峰峰位均沒有發生移動(藍或者紅移)，脂肪酶的峰高也未明顯改變。利用K2D軟件計算脂肪酶二級結構含量[17]的結果見表1，脂肪酶肽鏈中二級結構組成未發生顯著變化(P>0.05)：α-螺旋為15%、β-折疊為33%，無規則卷曲為52%。NaCl與KCl改變

圖2 無機鹽處理后商品化麥胚脂肪酶的CD圖譜

表1 無機鹽對商品化麥胚脂肪酶二級結構組成的影響

無機鹽種類無機鹽濃度/(×10-9mol/L)α-螺旋/%β-折疊/%無規則卷曲/%NaCl0153352114335321533524153352814335316143452KCl01533520.1143254115315421432541016305450143155100153154CaCl201533520.1153253115315421433531016325350153253100153352MgCl201533520.1143254116305421630541014335350153352100153253

脂肪酶的活力卻未改變脂肪酶的二級結構，推測可能是無機鹽影響了脂肪酶活性部位的柔性，而酶活性部位的柔性是酶充分表現活性所必需[18]，但是這種改變未導致二級結構的改變。鄒承魯等[19]研究表明酶活力的變化先于可察覺的構象的變化。

2.3 無機鹽對脂肪酶三級結構影響

熒光光譜法是研究溶液中蛋白質分子構象的一種有效的方法[18]，蛋白質的色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸殘基被一定波長的光源激發后能發射熒光，掃描得到的Imax和λmax的變化受到發色基團與周圍溶液環境的相互作用的影響[19]，因此，熒光光譜的變化可以說明脂肪酶分子的三級結構發生了改變[1]。脂肪酶-鹽溶液的λ溶液的紅移，表明脂肪酶芳香族氨基酸分子的側鏈基團逐漸暴露于溶液中，其所處環境的疏水性降低，脂肪酶三級結構改變[20]。添加NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2后，脂肪酶-鹽溶液的λ溶液的發生不同程度的紅移，表明無機鹽對脂肪酶三級結構產生影響。

為了排除無機鹽Tris-HCl緩沖液對熒光測定結果的影響，本研究對未添加脂肪酶的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24種無機鹽Tris-HCl緩沖液進行熒光光譜分析。脂肪酶真實的熒光強度(ΔImax)是脂肪酶-鹽溶液與無機鹽Tris-HCl緩沖液兩部分Imax的差值。

表2表明，不同濃度、不同種類的無機鹽對脂肪酶結構的影響不同。脂肪酶-NaCl溶液的ΔImax下降，推測NaCl使脂肪酶肽鏈伸展度增加，部分芳香族氨基酸殘基暴露到分子表面與極性溶液接觸后其發出的熒光被極性環境淬滅[7，20]，表明NaCl改變了脂肪酶周圍結合水的狀態破壞了蛋白質的水合層，使脂肪酶分子的水化半徑的增加[21]。脂肪酶-KCl溶液、脂肪酶-CaCl2溶液和脂肪酶-MgCl2溶液的ΔImax增加，表明脂肪酶分子中生色基團周圍環境的疏水性增強酶與底物親和力增強，而疏水相互作用在很大程度上影響了脂肪酶的構象。

由圖3a可知，隨著NaCl濃度的增加，脂肪酶的ΔImax先降低后增加，NaCl濃度為4×10-9mol/L時脂肪酶的ΔImax最低。由圖3b可知，隨著KCl、CaCl2、MgCl2濃度的增加，脂肪酶的ΔImax增加呈上升趨勢，與本研究中的4種無機鹽對脂肪酶活性的影響規律一致，可見脂肪酶活力大小與熒光強度呈正相關，通過ΔImax的變化可預測脂肪酶活力的變化。因此，NaCl、KCl、CaCl2和MgCl24種無機鹽使脂肪酶的三級結構發生了改變。

綜合考慮無機鹽對胚芽來源的脂肪酶活性，結構等影響因素，本試驗選取NaCl、KCl為添加無機鹽，研究其對小麥胚芽中脂肪酶活性的影響。

2.4 無機鹽對麥胚中脂肪酶活力的影響

長期以來，研究者嘗試各種手段鈍化麥胚中脂肪酶的活性，來實現麥胚的穩定化[22]。已有研究證實，向谷物、油料種子中添加無機鹽可以有效抑制脂肪酶活力，該法成本低、不易引發脂質自動氧化，能夠有效保留原料的營養價值[23-24]。目前，國外研究者開展了無機鹽對小麥、麩皮等物料中脂肪酶活力與物料品質影響的研究，本試驗也就NaCl、KCl對麥胚中脂肪酶活力的影響進行了探究。由圖4可知，隨著NaCl、KCl添加量的增加，脂肪酶活力顯著下降(P<0.05)，1.30%的NaCl使脂肪酶活力降低了62.49%，0.75% KCl使脂肪酶活力降低了61.27%，有利于延長麥胚的貯藏期，這與前人研究一致[2，4]。

表2 無機鹽對商品化麥胚脂肪酶熒光特性的影響

圖3 無機鹽對商品化麥胚脂肪酶熒光強度的影響

圖4 無機鹽對麥胚脂肪酶活力的影響

圖5 無機鹽對麥胚酸價的影響

2.5 無機鹽對麥胚酸價的影響

由圖5可知，未添加無機鹽的麥胚酸價為14.20 mgKOH/g，添加一定比例的NaCl和KCl均會對麥胚酸敗具有一定的抑制作用，這可能是因為無機鹽對麥胚中脂肪酶的活性產生了抑制作用，從而降低了麥胚的酸敗速率，這與前人研究結果一致[2，4]。綜上，向麥胚中添加1.30%的NaCl和0.75%的KCl，既能延緩麥胚酸敗，又可以被消費者接受。

3 結論

NaCl對商品化麥胚脂肪酶活力有抑制作用，使酶活力降低了21.8%，可作為麥胚脂肪酶的有效抑制劑；而KCl、CaCl2和MgCl2對商品化麥胚脂肪酶的活力無明顯影響。對于麥胚中的脂肪酶，添加1.30%的NaCl和0.75%的KCl可以使得麥胚脂肪酶活力與酸價顯著降低，其中NaCl延緩麥胚酸敗的能力強于KCl，NaCl對麥胚中脂肪酶有顯著抑制作用。因此，向麥胚中添加NaCl可以作為延長麥胚貯藏期的一種有效手段。

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Effect of Inorganic Salt on the Activity of Wheat Germ Lipase

Chen Zhongwei Wang Keke Liu Yanxia Xu Bin

(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University;Institute of Agriculture Products Process Engineering，Zhenjiang 212013)

To exploit a new method to stabilize wheat germ，the structure of wheat germ lipase were analyzed after adding inorganic salt using circular dichroism and fluorescence spectrum.Moreover，the activity of lipase in wheat germ and the acid-value of germ were also studied after adding different inorganic salt.The results showed that when the content of NaCl was 4×10-9mol/L，the activity of lipase decreased by 21.8%，while KCl had no significant effect on the activity of wheat germ lipase.However，the activity of wheat germ lipase increased after adding CaCl2and MgCl2.After adding salts，the secondary structure of the lipase was not changed，while the tertiary structure of the lipase was changed after adding NaCl.Compared to the wheat germ without adding inorganic salt，the activity of the lipase in wheat germ and acid-value of the wheat germ decreased，the content of NaCl was 1.3% and KCl was 0.75%，the activity of lipase decreased 62.49% and 61.27%.Therefore，adding salt could be used to inhibit the activity of wheat germ lipase and extend the storage period of wheat germ.

wheat germ，lipase，inorganic salt，structure，enzyme activity

國家自然科學基金面上項目(31371877)，國家博士后基金特別資助(2013T60510)

2015-11-16

陳中偉，男，1985年出生，講師，糧油深加工

徐斌，男，1969年出生，教授，糧油深加工

TS-3

A

1003-0174(2017)06-0008-07