BP神經網絡結合響應面優化羅布麻總黃酮的提取工藝

王慧竹，陳盟杰，石琳，朱文靜，楊鑫

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022；2.吉林大學藥學院，吉林長春130021）

BP神經網絡結合響應面優化羅布麻總黃酮的提取工藝

王慧竹1，2，陳盟杰1，石琳1，朱文靜1，楊鑫1

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022；2.吉林大學藥學院，吉林長春130021）

為研究酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮的提取工藝，以總黃酮提取率為評價指標，考察酶用量、酶解pH值、酶解溫度、超聲時間對羅布麻總黃酮提取率的影響，在單因素試驗基礎上，利用響應面法優化總黃酮提取工藝，以響應面試驗數據作為BP神經網絡的輸入值，對主要影響因素進行仿真優化。結果顯示，羅布麻總黃酮的最佳提取工藝條件為：酶用量0.11 g/g、酶解pH5.1、酶解溫度67℃、超聲時間33 min。在此工藝條件下，羅布麻總黃酮提取率為32.26%。

BP神經網絡；響應面法；羅布麻；總黃酮

羅布麻（Apocynum venetumL.）屬于夾竹桃科多年生宿根性草本植物，又名紅麻、茶葉花、紅柳子，在我國遼寧、吉林、內蒙古、甘肅、山東等地均有分布。《中國藥典》記載其“性甘、苦、涼，歸肝經，具有平肝安神，清熱利水的功效。主要用于肝陽眩暈、心悸失眠、浮腫尿少”[1]。現代藥理研究表明，黃酮類化合物是羅布麻最主要的活性成分[2]，具有調節血壓、降血脂、保肝、抗抑郁、抗氧化、鎮靜等功效[3-7]，目前從羅布麻中提取黃酮類化合物的方法主要有煎煮法[8]、熱回流提取法[9]、索式提取法[10]、微波輔助提取法[11]、超聲提取法[12]、閃式提取法[13]等。在提取工藝的研究過程中必定要涉及到優化問題，目前較常用的有正交設計、因子設計、均勻設計、中心復合設計等。

人工神經網絡是近年來研究和應用都十分活躍的一種信息處理工具，主要是在對人腦組織結構和運行機制的認識理解基礎上，模擬其結構和智能行為的一種工程系統。BP神經網絡（back propagation neural network）是人工神經網絡中基于誤差反向傳播算法的多層前饋神經網絡，利用BP網絡能從試驗數據中自動獲取數學模型，它無須事先給出公式的形式，而是以試驗數據為基礎，經過訓練后獲得一個反映試驗數據內在規律的數學模型，訓練好的神經網絡能直接進行推理，此外神經網絡在處理規律不明顯、變量多的問題時具有優越性[18]。

本研究采用響應面試驗與BP人工神經網絡相結合，優化酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮的工藝條件。以期為進一步開發羅布麻總黃酮資源提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻：吉林市吉林大藥房；蘆丁對照品（純度＞98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；亞硝酸鈉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津市光復精細化工研究所；纖維素酶（酶活力＞40 000 U/g）：寧夏夏盛實業集團有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1950雙光束紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水真空泵：河南鞏義市英峪儀器廠；RE-3000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SK2510HP超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；FA2204B電子天平：上海精科天美科學儀器有限公司；RT-08多功能粉碎機：榮聰精密科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 蘆丁對照品溶液的制備

精密稱取10.0mg蘆丁對照品，以體積分數為50%的乙醇溶液溶解并定容至50mL，搖勻，獲得質量濃度為0.20mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

稱取羅布麻葉3.0g，按料液比1∶10（g∶mL）加入體積分數為50%的乙醇溶液30 mL，調節溶液pH值為5.5，加入0.1 g/g纖維素酶，60℃水浴酶解120 min，然后設超聲功率200 W，超聲提取2次，每次40 min，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，定容至50 mL，即得供試品溶液。

1.3.3 蘆丁標準曲線的繪制

精密量取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL的蘆丁對照品溶液，置于10mL的容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min后，再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，并用體積分數為50%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min。以空白試劑為對照，于波長504 nm處測定吸光度值A。以質量濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，獲得蘆丁標準曲線回歸方程為A=13.03C+0.053 3，相關系數為0.999 8。

1.3.4 總黃酮的提取率的測定

精確吸取1.3.2中供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用體積分數為50%的乙醇溶液定容。按1.3.3方法測定其吸光度值，根據蘆丁標準曲線回歸方程計算供試品溶液中總黃酮的質量濃度，羅布麻中總黃酮提取率計算公式如下：

式中：W為總黃酮提取率，%；C為根據吸光度值計算出的溶液質量濃度，μg/mL；D為溶液稀釋倍數；V為供試品溶液體積，mL；m為藥材取樣量，g。

1.3.5 單因素試驗

以酶用量（按每克藥材用量計）、酶解pH、酶解溫度、超聲時間為主要影響因素進行單因素試驗，考察酶用量（0.06 g/g、0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g、0.15 g/g）、酶解pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、超聲時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）對羅布麻總黃酮提取率的影響。

1.3.6 響應面試驗

通過單因素試驗，選取酶用量（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）、超聲時間（D）為影響因素，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以羅布麻總黃酮提取率（Y）為評價指標，設計4因素3水平響應面分析[14]，以-1、0、1編碼分別代表自變量低、中、高水平，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 羅布麻總黃酮提取工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for total flavonoids extraction process optimization ofA.venetum

1.3.7 數據處理

單因素試驗結果和響應面試驗結果采用SAS 9.4軟件進行統計分析，圖表采用Origin 8.5軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對總黃酮提取率的影響

圖1 酶用量對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由圖1可知，總黃酮的提取率隨著酶用量的增大而增加。當酶用量從0.06 g/g增至0.10 g/g時，總黃酮提取迅速增加；繼續增加酶用量。總黃酮提取率增加變化不明顯。因此，選擇酶用量為0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g進行響應面試驗。

2.1.2 酶解pH對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，羅布麻總黃酮提取率隨pH的升高而增加，當酶解pH 5.0時總黃酮提取率達到最大，為31.5%；當酶解pH＞5.0時，總黃酮提取率隨pH的升高而下降。因此，選擇酶解pH為5.0、5.5、6.0進行響應面試驗。

圖2 酶解pH對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

2.1.3 酶解溫度對總黃酮提取率的影響

圖3 酶解溫度對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由圖3可知，隨酶解溫度的增加，總黃酮提取率呈先增加后減少的趨勢，當酶解溫度從40℃升高至60℃時，總黃酮提取率逐漸增加，并到達最大值，為31.1%；繼續增加酶解溫度，羅布麻總黃酮提取率開始下降，因此，選擇酶解溫度為50℃、60℃、70℃進行響應面試驗。

2.1.4 超聲時間對總黃酮提取率的影響

圖4 超聲時間對羅布麻總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由圖4可知，羅布麻總黃酮提取率隨超聲時間的延長而增加，當超聲時間在20～30 min范圍內時，總黃酮提取率隨著時間的延長不斷增大，超聲時間＞30 min后，提取率基本上保持不變。因此，選擇超聲時間為30min、40min、50min進行響應面試驗。

2.2 響應面試驗結果及數據分析

2.2.1 響應面試驗設計方案及結果

在單因素試驗結果的基礎上，選取酶用量（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）、超聲時間（D）為自變量，以羅布麻總黃酮提取率（Y）為評價指標，進行響應面試驗，其試驗結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

表2 羅布麻葉總黃酮提取工藝優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for total flavonoids extraction process optimization ofA.venetum

利用SAS 9.4軟件對表2數據進行回歸分析，得到以總黃酮提取率（Y）為響應值的羅布麻葉總黃酮提取工藝參數多元二次回歸方程：

Y=-291.758+1310.375A+69.075B+1.159C+1.3393D-5129.167A2-61AB+4.2875AC-4.475AD-4.981667B2-0.1295BC+0.0025BD-0.005 904C2-0.002CD-0.009 867D2

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.216 4＞0.05），說明回歸方程擬合度良好，失擬因素對方程干擾較小。方程的決定系數R為0.932 5，說明響應值的變化有93.25%來源于所選變量，一次項A、C對結果影響極顯著（P＜0.01），說明酶用量、酶解溫度對羅布麻總黃酮提取率均具有極顯著影響；而交互項AC、AD對結果影響極顯著（P＜0.01）；交互項AB顯著水平（P＜0.05）；二次方項A2、B2和D2對結果影響極其顯著（P＜0.01），而二次方項C2對結果影響影響呈顯著水平（P＜0.05）。表明試驗得到的回歸方程有效性和實用性良好，可用于分析酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮工藝結果。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應面分析與優化

為了更加直觀地表達各因素交互作用對羅布麻總黃酮提取率的影響，可以固定其中兩個因素的值為零水平對應的值，考慮另兩個因素對總黃酮提取率的影響，根據回歸方程繪制響應曲面圖和等高線圖，結果如圖5所示。由圖5可知，曲面越陡峭，表明該因素對總黃酮提取率的影響越顯著，響應值也越大；從等高線可以看出總黃酮提取率的最佳條件應該在圓心處[15-17]。酶用量與酶解溫度的交互作用、酶用量與超聲時間的交互作用、酶用量與酶解pH的交互作用對羅布麻總黃酮的提取率影響比較顯著，而這與表3的分析結果正相吻合。

利用SAS9.4軟件RSREG語句對模型進行典型性分析，得到羅布麻總黃酮提取的最佳工藝為：酶用量0.112g/g，酶解pH值5.28，酶解溫度64.95℃，超聲時間35.50 min，在此工藝條件下，羅布麻葉總黃酮提取率的理論預測值為31.34%，考慮到實際操作情況，將最佳工藝條件修正為酶用量為0.11 g/g，酶解pH值5.3，酶解溫度65℃，超聲時間36 min，在此工藝條件下，經過5次重復性驗證試驗，獲得羅布麻總黃酮提取率為31.10%。

2.3 BP神經網絡試驗結果分析

在酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮提取率的響應面分析基礎上，進行神經網絡訓練及仿真，采用27組試驗數據進行訓練，其中輸入層為4，分別是酶用量、酶解pH、酶解溫度及超聲時間。隱藏層的數目訓練次數等對結果有顯著影響（P＜0.05），經過多次建模，最終確定隱藏層數目為35層。建立人工神經網絡，網絡訓練次數為10 000，精度為0.01，訓練函數為‘trainscg’。當網絡訓練至2099步時達到訓練精度的要求（即0.01），將網絡仿真值與響應面試驗結果實測值進行比較[19]，結果見表4。

圖5 酶用量、酶解pH、酶解溫度和超聲時間交互作用對總黃酮提取率影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effect of interaction between enzyme addition,enzymolysis pH,enzymolysis temperature and ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

表4 網絡仿真值與實測值的模擬誤差Table 4 Simulation error of network simulation value and practical measured value

由表4可知，運用訓練后的網絡對主要因素進行仿真與優化，得出神經網絡的最佳提取工藝為：酶用量0.114 g/g、酶解pH5.15、酶解溫度67℃、超聲時間33 min，在此條件下，總黃酮提取率預測值為32.12%。結合實際操作情況，將最佳工藝條件修正為酶用量0.11 g/g、酶解pH5.1、酶解溫度67℃、超聲時間33 min，在此條件下，總黃酮提取率實測值為32.26%。

BP神經網絡模型預測值與實測值的相對誤差（0.44%）較響應面優化的相對誤差（0.77%）小，且BP神經網絡優化的工藝條件所提取的黃酮提取率更高，說明該BP神經網絡模型可以更好地預測不同工藝參數下羅布麻葉中總黃酮的提取率。

3 結論

本研究采用酶法輔助超聲波提取羅布麻總黃酮，在單因素試驗基礎上通過響應面試驗設計優化提取工藝，再以響應面試驗數據為基礎經過建立BP神經網絡模型，并對所建的模型進行訓練和仿真預測檢驗樣本。結果表明，羅布麻總黃酮提取的最佳工藝條件為：酶用量0.11g/g、酶解pH5.1、酶解溫度67℃、超聲時間為33min。在此工藝條件下，羅布麻總黃酮提取率預測值為32.12%，實測值為32.26%，網絡預測值和實測值的相對誤差為0.44%＜1.0%，表明建立的BP神經網絡模型預測性能良好，可對羅布麻總黃酮提取結果進行預測。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部（2015版）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2]鄭永紅，韋曉瑜，龍繼紅.羅布麻葉中黃酮類成分研究進展[J].今日藥學，2010，20（8）：5-7.

[3]張素瓊，燕虹，李青山.羅布麻葉有效部位降血脂及抗動脈粥樣硬化的研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2007，5（9）：831-832.

[4]XIONG Q,FAN W,YOKOZAW T,et al.Hepatoprotective effect of Apocynum venetumand its active constituents[J].Planta Med,2000, 66(2):127-133.

[5]BUTTERWECK V,NISHIBE S,SASAKI T,et al.Antidepressant effects ofApocynum venetumleaves in a forced swimming test[J].Biol Pharm Bull,2001,24(7):848-851.

[6]SANDEI N,MICHIKO M,CHISAKO C,et al.Flavonid content inApocynumandPoacynumleaves and lipid-peroxidation-inhibiting effect of flavonoids[J].Nat Med,1994,48(4):322-323.

[7]曾斌芳，田莉，燕雪花.新疆羅布麻的藥理作用和現代應用研究進展[J].中國民族民間醫藥，2009，26（2）：11-13.

[8]盛萍，王新鈴，楊學斌.羅布麻總黃酮提取工藝的優選[J].時珍國醫國藥，2006，17（4）：587-588.

[9]楊志芳，王維娜，楊坤，等.正交設計優選羅布麻葉中總黃酮提取工藝[J].中草藥，2006，37（8）：1177-1178.

[10]周麗，王效山，黃和平，等.不同產地羅布麻葉總黃酮的含量測定[J].現代中藥研究與實踐，2005，19（5）：37-38.

[11]王慧竹，張闖，劉超.正交試驗法優化羅布麻總黃酮微波提取工藝[J].吉林化工學院學報，2013，30（9）：23-25.

[12]耿巖玲，李福偉，王曉，等.羅布麻中黃酮的超聲波強化提取及高速逆流色譜分離純化[J].食品科學，2007，28（12）：47-48.

[13]白明，李連珍，王亞寧，等.正交試驗法優化羅布麻葉中總黃酮的閃式提取工藝[J].安徽農業科學，2013，41（18）：7761-7762，7767.

[14]陳帥，王慧竹，薛健飛，等.響應面法優化超聲提取野葛莖中葛根素的工藝[J].廣東農業科學，2015，42（4）：60-66.

[15]JEAN B J,MARION A,CARLOS V G,et al.Response surface methodology to optimise accelerated solvent extraction of steviol glycosides fromStevia rebaudianaBertoni leaves[J].Food Chem,2015,166(1): 561-567.

[16]陳帥，王慧竹，朱琳，等.微波輔助雙水相提取千斤拔總黃酮的工藝研究[J].河南工業大學學報，2015，36（6）：83-89.

[17]張玲，李繼昌，許薇，等.響應曲面優化紫花地丁總黃酮提取工藝研究[J].東北農業大學學報，2013，44（6）：1-6.

[18]趙麗麗，陳寧，熊明勇，等.利用神經網絡對L-纈氨酸發酵建模[J].無錫輕工業大學學報，2003，22（2）：44-47.

[19]蔣益虹，沈益明.人工神經網絡用于紅區楊梅果酒生產工藝的優化[J].浙江大學學報：農業與生命科學版，2003，29（3）：275-279.

Optimization of extraction process of total flavonoids fromApocynum venetumby BP neural network and response surface methodology

WANG Huizhu1,2,CHEN Mengjie1,SHI Lin1,ZHU Wenjing1,YANG Xin1
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022,China; 2.Pharmaceutical School，Jilin University，Changchun 130021,China）

In order to study the extraction process of total flavonoids fromApocynum venetumby enzymatic assisted ultrasonic extraction,using the total flavonoid extraction rate as evaluation indexes,the effects of enzyme addition,enzymolysis pH,enzymolysis temperature and ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids fromA.venetumwas investigated.On the basis of single factor experiments,extraction process conditions of total flavonoid were optimized by response surface methodology(RSM).With RSM data as input value of BP neural network,the main influence factors were simulated and optimized.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids fromA.venetumwere enzyme 0.11 g/g,enzymolysis pH 5.1,enzymolysis temperature 67℃and ultrasonic time 33 min.Under the conditions,the extraction rate of total flavonoids fromA.ventrumwas 32.26%.

BP neural network;response surface methodology;Apocynum venetum;total flavonoids

R931.6

0254-5071（2017）06-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.031

2017-02-25

吉林化工學院科學技術研究項目（吉化院合字[2013]第44號）；吉林市科技創新計劃項目（20161215）

王慧竹（1981-），女，講師，博士研究生，研究方向為體內藥物分析。