高效液相色譜法測定糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

王麗君，禹潔，蘇阿龍，賈紅芳，朱書強*

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅蘭州730030）

高效液相色譜法測定糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

王麗君，禹潔，蘇阿龍，賈紅芳，朱書強*

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅蘭州730030）

利用純水溶解提取糧谷類樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，經過免疫親和柱凈化，并優化提取凈化條件，通過高效液相色譜檢測其含量。結果表明，采用2 mL濾液上樣，經氮吹儀在40℃吹干后，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）定容，在波長220 nm條件下進行檢測，色譜峰分離效果良好。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量在20～500 ng/mL范圍內線性關系良好（R2=0.999 8），檢出限2 μg/kg，精密度試驗結果相對標準偏差（RSD）值為2.4%，回收率為87.6%～98.9%，RSD值為2.04%～2.68%，表明該方法具有良好的精密度和準確性，適用于糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的定量分析檢測。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；糧谷類；免疫親和柱；高效液相色譜

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是鐮刀菌屬（Fusarium）產生的一種B型單端孢霉烯族真菌毒素，對動物和人都具有很強的致嘔吐能力，因此又被稱為“嘔吐毒素（vomitoxin）”[1]。其主要存在于小麥、大麥、燕麥、黑麥、玉米、大米等谷物及其制品中，在全球范圍內具有很高的污染率[2]。DON既能引起急性中毒也可造成慢性損害。動物急性中毒主要表現為嘔吐、拒食、體質量降低和腹瀉，人群DON急性中毒癥狀包括惡心、嘔吐、胃腸紊亂、頭暈、頭痛和腹瀉，慢性中毒表現為攝食減少、生長緩慢及血清免疫球蛋白水平改變[3]。因此建立DON的分析檢測方法，對于糧谷類食品中DON的暴露和風險評估具有重要意義。

目前對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測方法主要有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（highperformance liquidchromatography，HPLC）、柱凈化法結合電子捕獲檢測器的氣相色譜法（column purification methodcombinedwithelctroncapturedetectorgaschromatography，GC-ECD）、高效液相色譜串聯質譜法（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）、放射性免疫測定法（radioimmunoassays，RIAs）等[4-9]；馬冬月等[10]采用酶聯免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分別檢測了小麥、大麥、燕麥、黑麥、玉米、大米等谷物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，檢測結果回收率低，不能準確定量。游淑珠[11]提出了采用乙腈-水提取糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，以用N-七氟丁酰咪唑衍生，GC-ECD檢測；唐吉旺等[12]提出谷物樣品經乙腈-水溶液提取，離心后經自制中性氧化鋁-活性炭-二氧化硅固相萃取柱凈化，氣相色譜檢測；李華[13]提出了酶聯免疫吸附的測定方法；張鵬等[14]提出了采用免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC）或多功能凈化柱（multifunctional purification column，MFC）凈化，用高效液相色譜法檢測。上述方法前處理步驟繁瑣，分析時間長，試驗成本高，提取效率低，靈敏度和特異性差，結果存在一定的假陽性，不能準確地定量。因此，本研究采用免疫親和柱凈化，建立高效液相色譜檢測糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法，以期為快速準確地測定糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇提供技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉樣品、啤酒大麥、小麥粉、糧谷制品：市售；脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準液（質量濃度100 μg/mL）：上海酶聯生物有限責任公司；甲醇（色譜純）：北京百靈威科技有限責任公司；氯化鈉（分析純）天津新沃化工有限責任公司；磷酸氫二鈉（分析純）：北京康普匯維科技有效責任公司；氯化鉀（分析純）：武漢興眾誠科技有限公司；鹽酸（分析純）：河北固安清遠化工試劑廠；聚乙二醇（純度＞99%）：天津中和盛泰化工有限責任公司；玻璃纖維濾紙（直徑11cm，孔徑1.5 μm）：杭州沃華濾紙有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）：美國沃特世公司；H1650型離心機：長沙湘儀科技有限責任公司；Vortex-Genie渦旋儀：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；1 250 ng/3 mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱：ROMER國際貿易（北京）有限公司；AccuPrep SPE48位高通量正壓固相萃取儀：美國J2 Scientific公司；GenPure UV-TOC/UF× CAD plus超純水器：賽默飛世爾科技有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

取1.00 mL 100 μg/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈+水（2+8）定容，得到10 μg/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準中間液。分別吸取標準中間液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈-水（20∶80，V/V）定容，搖勻后得到質量濃度分別為20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準系列工作液，經0.45 μm過濾后，采用高效液相色譜儀檢測，以脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準工作液質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程。

1.3.2 樣品前處理方法

準確稱取糧谷類樣品25 g于100 mL離心管中，加入80 mL超純水，高速渦旋5 min，超聲提取30 min，加水定容至100 mL，靜置10 min，用玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱放置至室溫，頂部連接一支30 mL注射器，置于高通量正壓固相萃取儀上，取2 mL濾液于30 mL注射器內，控制流速1滴/s的速度通過免疫親和柱。用5 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）和5mL去離子水先后淋洗免疫親和柱。直至空氣進入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準確加入3 mL甲醇洗脫，流速控制在1滴/s，收集流出液于10 mL離心管中，40℃氮氣保護吹干，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）溶解，經0.45 μm過濾后，待高效液相色譜儀測定[15-16]。

1.3.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Waters C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈-水（20∶80，V/V）等度洗脫；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min，檢測波長：220 nm，進樣量50 μL。

2 結果與分析

2.1 樣品的提取與凈化柱的選擇

[17]報道，糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇大多采用純水或甲醇水提取，提取液經免疫親和柱凈化，但甲醇毒性大，損害人體健康，且對環境有危害。本試驗采用純水提取，在渦旋儀上高速渦旋5 min，超聲提取30 min，提取液分別用硅膠柱和經有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特異抗原的免疫親和柱凈化，結果表明特異抗原的免疫親回收率高，特異性強。

2.2 上柱體積的優化

在糧谷類樣品中加入不同體積（0.5 mL、1.0 mL、5 mL）的10 μg/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準溶液，使樣品中脫氧血腐鐮刀菌烯醇的含量分別為1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，按照1.3的方法測定其含量，并計算回收率，評價試驗效果。考察上柱體積對回收率的影響，結果見表1。由表1可知，上柱體積為1.0mL時，回收率為56.01%～60.10%；上柱體積為2.0 mL時，回收率為95.62%～100.81%；上柱體積為5.0 mL時，回收率為64.21%～74.32%；上柱體積為10.0 mL時，回收率為50.32%～60.32%。因此，本實驗最終采用上柱體積為2.0 mL。

表1 上柱量優化結果(n=4)Table 1 Optimization results of sampling volume(n=4)

2.3 色譜條件的優化

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是極性化合物，流動相以水作為基礎溶劑，在波長190～400 nm范圍內進行全波長掃描，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在波長220 nm處有最大吸收。且雜峰和基線噪音干擾少。通過上述優化的方法，采用乙腈-水（20∶80，V/V）作為流動相時，考察對色譜分離效果的影響，對脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準品及樣品進行檢測，檢測結果見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，目標物色譜峰目標峰與樣品雜峰分離良好，色譜峰形尖銳對稱，沒有產生拖尾及前沿等現象。且采用乙腈-水（20∶80，V/V）為流動相時，流動相的配比簡單，毒性小。

圖1 脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準品（A）及樣品（B）高效液相色譜圖Fig.1 HPCL chromatogram of deoxynivalenol standard substance (A)and the sample(B)

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的建立

采用上述優化的色譜條件對脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準工作液進行檢測，以脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準工作液質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準曲線線性回歸方程、相關系數、檢出限（limit of detection，LOD）結果見表2。

表2 脫氧血腐鐮刀菌烯醇線性回歸方程、相關系數及檢出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and limit of detection of deoxynivalenol

由表2可知，脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準曲線回歸方程為：y=67.891x+0.033，相關系數R2=0.999 8。將樣品標準工作液逐級稀釋，以3倍信噪比時的質量濃度為能檢測的最低質量濃度，該方法線性范圍寬，適合不同濃度樣品的分析。當3倍信噪比對應的目標物最低響應濃度為儀器最低檢出限，根據稀釋倍數計算方法檢出限。樣品前處理方法采用稀釋2倍的形式，根據本方法中樣品的取樣量和定容體積，測得方法的檢出限為2.0 μg/kg。

2.4.2 精密度試驗結果

取6份100 ng/mL脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準品，按上述優化的方法進行處理、測定，平行測定6次，計算結果的平均值及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表3。

表3 精密度試驗結果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準品的RSD值為2.4%＜5.0%，說明該檢測方法精密度良好。

2.4.3 回收率試驗

在糧谷類樣品中分別加入10 μg/mL的脫氧血腐鐮刀菌烯醇標準溶液，使樣品中脫氧血腐鐮刀菌烯醇添加量分別為1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL，按照1.3的方法測定其含量，并計算回收率，結果見表4。由表4可知，脫氧血腐鐮刀菌烯醇的回收率為87.6%～98.9%，RSD值為2.04%～2.68%，表明方法準確度較高，可以用于檢測糧谷類中脫氧血腐鐮刀菌烯醇含量的檢測。

表4 回收率試驗結果Table 4 Results of recovery rate tests

2.5 樣品的測定

應用所建立的檢測方法分別檢測小麥粉、玉米粉、啤酒大等樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，結果表明部分樣品有污染現象，其中小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量范圍在0.41～2.88μg/kg，玉米粉其含量范圍在10.63～25.88μg/kg，啤酒大麥其含量范圍在10.63～55.23 μg/kg，從檢測結果看小麥粉中污染風險較低，3種糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量均符合GB/T 2761—2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》[18]中規定的限量。

3 結論

本研究建立了免疫親和柱結合高效液相色譜法測定糧谷類中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的分析檢測方法。采用2 mL濾液上樣，經氮吹儀在40℃時吹干后，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）定容，在波長220 nm條件下進行檢測，色譜峰分離效果良好。結果表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量在20～500 ng/mL范圍內線性關系良好（R2=0.999 8），方法檢出限為2 μg/kg。精密度試驗結果RSD值為2.4%，回收率為87.6%～98.9%，RSD值為2.04%～2.68%。表明該方法準確可靠，特異性強，靈敏度高，可作為糧谷類樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇快速定量分析。

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Determination of deoxynivalenol in cereals by HPLC

WANG Lijun,YU Jie,SU Along,JIA Hongfang,ZHU Shuqiang*
(Gansu Institute of Food Inspection,Lanzhou 730030,China)

The deoxynivalenol in cereals samples was extracted by purified water and purified by immunoaffinity column,and the conditions of extraction and purification were optimized.The condition of deoxynivalenol was determined by HPLC.The results showed that filtrate 2 ml was dried at 40℃by termovap sample concentrator,with 1 ml acetonitrile-water(20∶80,V/V)constant volume,and then detected at wavelength of 220 nm. The separation effect of chromatographic peak was good.The deoxynivalenol had a good linear relationship in the range of 20-500 ng/ml(R2=0.999 8). The limit of detection was 2 μg/kg.The relative standard deviation(RSD)of precision tests results was 2.4%.The recovery rate was 87.6%-98.9% and the RSD was 2.04%-2.68%,which indicated the method could be used for the quantitative analysis and detection of deoxynivalenol content in cereals since it had the good precision and accuracy.

deoxynivalenol;cereals;immunoaffinity column;HPLC

O657.7

0254-5071（2017）06-0179-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.037

2017-02-21

王麗君（1981-），女，助理工程師，大專，研究方向為食品檢測。

*通訊作者：朱書強（1981-），男，工程師，博士，研究方向為食品毒素分析與研究。