泥蒿葉總黃酮的酶法提取及其抗氧化活性評價

陳瑤，吳龍月，向福，2*，曹佩佩，向睿富，方元平，2

（1.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃岡438000）

泥蒿葉總黃酮的酶法提取及其抗氧化活性評價

陳瑤1，吳龍月1，向福1，2*，曹佩佩1，向睿富1，方元平1，2

（1.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃岡438000）

以大別山黃州地區泥蒿葉為原料，采用酶法輔助提取總黃酮。基于單因素和正交試驗優化了泥蒿葉總黃酮的酶法提取工藝，并探討了總黃酮提取物的抗氧化活性。結果表明，總黃酮提取的最佳工藝為纖維素酶用量3%，乙醇體積分數40%，料液比1∶10（g∶mL），提取溫度50℃，提取時間4 h。在此條件下，總黃酮提取率為4.12%。泥蒿葉總黃酮提取液總抗氧化能力相當于相同質量濃度VC的50%，羥基自由基清除能力是相同質量濃度VC的1.4～2.7倍，表明其具有較強的抗氧化活性。

泥蒿葉；總黃酮；酶法提取；抗氧化活性；羥基自由基清除能力

泥蒿（Artemisia selengensis）是菊科（Asteraceae）蒿屬多年生宿根草本植物，學名狹葉艾，又名水艾、蘆蒿、蔞蒿、藜蒿、水蒿等[1]，廣泛分布于華北、東北及長江中下游等地區。《神農本草經》記載泥蒿“久服輕身，耳聰目明，不老”；《本草綱目》描述其“補中益氣，利膈開胃，療心懸”、“祛風寒濕痹”；民間以其全草入藥，可治創傷、急性肝炎、寒冷腹痛等，且無副作用[2]。因此，泥蒿是一種集食用和藥用于一身的保健蔬菜，在醫藥保健領域具有廣闊的應用前景。

大別山地區泥蒿資源豐富，以采食其冬春季節的嫩莖為主，成熟的老莖、葉則大量廢棄。泥蒿及其葉富含黃酮、谷甾醇及香豆素等生物活性物質[2-4]，而黃酮類化合物則被認為是泥蒿的主要活性成分[5-6]，具有防衰老、抗氧化、增強機體免疫力、抑菌、降血脂、降血糖、降血壓以及緩解心血管疾病等功效[3，7-9]。探討綠色環保、經濟可行的泥蒿葉黃酮提取工藝，對綜合利用泥蒿資源，發展高附加值的泥蒿產業具有較好的經濟效益和現實意義。

乙醇價廉易得且毒性小，便于回收使用，故植物總黃酮的提取多采用醇提法[10]。文獻報道纖維素酶通過酶解細胞壁不僅能促進植物活性成分的溶出，且和乙醇聯用提取黃酮類物質還具有協同作用[11-12]。本研究以大別山黃州地區泥蒿葉為研究對象，采用酶法輔助乙醇提取泥蒿葉中總黃酮，通過單因素和正交設計試驗優化提取工藝條件，并利用總抗氧化活性和羥基自由基清除能力評價泥蒿葉總黃酮提取物的抗氧化活性，以期為綜合利用泥蒿資源、生產高附加值的黃酮類物質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥蒿葉：采自黃岡市黃州區春陽蔬菜合作社基地，陰干、粉碎備用；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）：上海新寶精細化工廠；蘆丁標準品（分析純）：上海金穗生物科技有限公司；酸性纖維素酶（20 000 U/g）CAS 9012-54-8：湖北帝鑫化工制造有限公司；維生素C（vitamin C，VC）標準品（純度≥99.99%）：上海麥克林生化科技有限公司；總抗氧化試劑盒（批號20161117）、羥基自由基試劑盒（批號20161121）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

FA2104電子分析天平：上海精細天平有限公司；Cary-100紫外可見分光光度計：美國Varian公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區醫療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線及總黃酮提取率測定

根據文獻[13]的方法，準確稱取蘆丁標準品10.66 mg，用體積分數60%乙醇溶液配成母液，分別取母液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL于25 mL容量瓶中，加體積分數為60%乙醇溶液5.5 mL，加5%亞硝酸鈉1 mL后搖勻放置6 min，加入10%的硝酸鋁溶液1 mL后搖勻放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，用體積分數60%乙醇溶液定容至刻度，放置15 min后，以未加入標準品溶液的試劑為空白，在波長509 nm處檢測其吸光度值，以蘆丁質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，得蘆丁標準曲線回歸方程為：A=12.197C+0.003 9，R2=0.999 6，表明蘆丁質量濃度在8.6～59.7 μg/mL范圍內與吸光度值線性關系良好。根據蘆丁標準曲線方程計算泥蒿葉樣品中總黃酮的含量及總黃酮提取率，總黃酮提取率計算公式如下：

式中：E為總黃酮提取率，%；C為提取液中總黃酮質量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；N為提取液稀釋倍數；m為泥蒿葉的質量，g。

1.3.2 單因素試驗

稱取5份泥蒿葉粉末5 g置于圓底燒瓶，分別考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、乙醇體積分數（20%、30%、40%、50%、60%）、纖維素酶量（泥蒿葉質量1%、2%、3%、4%、5%）、提取時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）和提取溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）等因素對泥蒿葉中總黃酮提取率的影響。

1.3.3 正交優化試驗

表1 總黃酮提取工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for total flavonoids extraction process optimization

在單因素試驗結果的基礎上，選取對泥蒿葉總黃酮提取率影響較顯著的纖維素酶用量（A）、提取時間（B）和乙醇體積分數（C）等因素進行正交試驗設計，正交試驗因素與水平如表1所示。

1.3.4 總抗氧化能力評價

分別配制0.065 g/L、0.130 g/L、0.220 g/L、0.260 g/L和0.325g/L系列質量濃度的泥蒿葉總黃酮提取液，并以相同質量濃度的VC溶液為陽性對照，根據總抗氧化試劑盒說明書操作后，將測試管、對照管樣液在波長520nm處測定吸光度值。

在37℃時，每毫升樣品每分鐘使反應體系的吸光度每增加0.01時，定義為一個總抗氧化能力單位（U），則總抗氧化能力計算公式如下：

式中：T為總抗氧能力，U/mL；As為測定管吸光度值；Ac為對照管吸光度值；Vt為反應液總體積，mL；Vs為取樣量，mL；n為樣品測試前稀釋倍數。

1.3.5 羥基自由基清除能力評價

分別配制0.065 g/L、0.130 g/L、0.220 g/L、0.260 g/L和0.325 g/L系列質量濃度的泥蒿葉總黃酮提取液，并以相同質量濃度的VC溶液為陽性對照，根據羥基自由基試劑盒說明書操作后，將測定管、空白管、對照管樣液在波長536 nm處測定吸光度值。羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：H為羥基自由基清除率，%；OD1為測定管吸光度值；OD2為對照管吸光度值；OD3為空白管吸光度值。

1.3.6 統計分析

利用正交設計助手II v3.1和EXCEL 2003軟件進行實驗設計和數據分析，通過F值分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 纖維素酶量對總黃酮提取率的影響

考察纖維素酶用量對總黃酮提取率的影響，結果如圖1所示。

圖1 纖維素酶用量對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，總黃酮提取率隨纖維素酶用量的增加呈先升后降趨勢，當纖維素酶用量為3%時，總黃酮提取率最高，為3.71%，繼續添加酶量，則總黃酮提取率下降。盡管纖維素酶用量為4%和5%時所得總黃酮提取率發生起伏變化，但二者統計分析并無顯著差異（P=0.33＞0.05）。這是因為酶量增加到一定程度時，酶分子過于飽和，一部分酶不能與底物結合，使得水解速度變慢[14]，且酶量太多則具有粘附性[15]，阻礙黃酮物質的溶出，從而使總黃酮得率下降。因此，選擇纖維素酶用量3%為宜。

2.1.2 提取時間對總黃酮提取率的影響

考察提取時間對總黃酮提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，隨著提取時間從1 h增加至3 h，總黃酮提取率達到峰值，為4.11%，繼續增加提取時間，總黃酮提取率下降趨勢明顯。這可能是由于隨著提取時間的延長，某些在乙醇溶液中對熱不穩定的黃酮類物質的結構被分解轉化或氧化破壞，從而導致總黃酮提取率出現下降的趨勢[16]。因此，選擇泥蒿葉總黃酮提取時間3 h為宜。

2.1.3 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

考察乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響，結果如圖3所示。

圖3 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，當乙醇體積分數為20%～40%時，總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增加而逐漸升高，當乙醇體積分數為40%時，總黃酮提取率達到峰值，為4.01%，繼續增加乙醇體積分數，總黃酮提取率則開始下降。這可能是由于隨著乙醇體積分數的增加，親脂性物質、色素等成分大量溶出，與黃酮類物質競爭結合乙醇-水分子[17-18]，從而降低了泥蒿葉總黃酮的提取效果。因此，選擇乙醇體積分數40%為宜。

2.1.4 提取溫度對總黃酮提取率的影響

考察提取溫度對總黃酮提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，隨著提取溫度的增加，泥蒿葉總黃酮提取率不斷上升，當提取溫度為50℃時，總黃酮提取率急劇增加至4.01%；60℃時達到最高提取率4.27%，然后趨于穩定。統計分析發現50℃和60℃條件下所得總黃酮提取率無顯著性差異（P=0.14＞0.05），即50℃時泥蒿葉總黃酮提取率已趨于穩定，繼續升高溫度提取率增幅不明顯。因此，綜合考慮選擇提取溫度50℃為宜。

2.1.5 料液比對總黃酮提取率的影響

考察料液比對總黃酮提取率的影響，結果如圖5所示。

圖5 料液比對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，料液比對泥蒿葉總黃酮提取率有顯著影響。料液比從1∶5（g∶mL）增加至1∶10（g∶mL）時，泥蒿葉總黃酮提取率增加到峰值，為5.32%，差異性顯著（P=0.04＜0.05）；繼續增加料液比，總黃酮提取率開始下降，且下降趨勢明顯（P=0.04＜0.05）。因此，選擇料液比1∶10（g∶mL）為宜。

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，固定料液比為1∶10（g∶mL），提取溫度50℃，以總黃酮提取率（Y）為評價指標，以纖維素酶用量（A）、提取時間（B）和乙醇體積分數（C）為變量因子，設計L9（33）正交優化試驗，試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 總黃酮提取工藝優化正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for total flavonoids extraction process optimization

由表2極差分析結果可知，各因素對總黃酮提取率的影響次序為：C＞B＞A，即乙醇體積分數＞提取時間＞纖維素酶用量，表3方差分析也表明乙醇體積分數對泥蒿葉總黃酮提取的影響達到顯著水平（P＜0.05），其他因素影響不顯著。總黃酮提取最佳工藝條件為A2B3C2，即纖維素酶用量為3%，提取時間為4 h，乙醇體積分數為40%。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 驗證試驗

在總黃酮提取最佳工藝條件下，即料液比1∶10（g∶mL）、提取溫度50℃、纖維素酶用量3%、提取時間4 h和乙醇體積分數40%，平行提取3次，總黃酮提取率為（4.12±0.09）%，高于表2中最大總黃酮提取率（3.86%），表明正交設計所確定的條件為優選。

2.4 總抗氧化能力評價

測定泥蒿葉提取液中總黃酮質量濃度為6.50 g/L，分別稀釋100倍、50倍、30倍、25倍、20倍后得到0.065 g/L、0.130 g/L、0.220 g/L、0.260 g/L和0.325 g/L等系列質量濃度的泥蒿葉總黃酮樣品，以VC為陽性對照，各樣品的總抗氧化能力如圖6所示。

圖6 泥蒿葉總黃酮和VC的總抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of total antioxidant activity of total flavonoids fromA.selengensisleaves and VC

由圖6可知，5種質量濃度泥蒿葉總黃酮提取液的總抗氧化能力均低于相同質量濃度的VC。當總黃酮提取液質量濃度從0.065 g/L增至0.130 g/L時，泥蒿葉總黃酮提取液和VC的總抗氧化能力急劇增加，增加至0.220 g/L時，二者的總抗氧化能力分別達到13.45 U/mL和27.06 U/mL，繼續增加溶液的質量濃度，二者的總抗氧化能力趨于穩定。泥蒿葉總黃酮提取液的總抗氧化能力相當于相同質量濃度VC的50%，表現出一定的抗氧化能力，但抗氧化能力不強，這可能是由于泥蒿葉中總抗氧化能力主要是由酚酸類物質決定，而黃酮類物質只是其中一種抗氧化成分[19-22]。

2.5 羥基自由基清除能力評價

泥蒿葉總黃酮和VC樣品的羥基自由基清除能力如圖7所示。

由圖7可知，泥蒿葉總黃酮提取液和VC的羥基自由基清除率均隨著質量濃度的升高而增加，當質量濃度為0.325 g/L時，羥自由基清除率達到最高，分別達到93.80%和64.14%；總黃酮提取液從0.130 g/L濃度開始，盡管差異性顯著（P＜0.05），但增幅較小；而VC的羥基自由基清除能力則上升趨勢明顯（P＜0.001）。五種質量濃度的泥蒿葉總黃酮提取液的羥基自由基清除能力均明顯高于相同質量濃度的VC，且羥基自由基清除率是相同質量濃度VC的1.4～2.7倍。因此，泥蒿葉總黃酮提取液具有較強的羥基自由基清除能力。

圖7 泥蒿葉總黃酮和VC的羥基自由基清除能力的比較Fig.7 Comparison of hydroxyl radical scavenging activity of total flavonoids fromA.selengensisleaves and VC

3 結論

本研究以大別山黃州地區泥蒿葉為材料，在單因素試驗結果的基礎上，采用正交試驗對酶法提取泥蒿葉總黃酮的工藝進行了優化。結果表明，總黃酮提取的最佳工藝條件為纖維素酶用量3%，乙醇體積分數40%，料液比1∶10（g∶mL），提取溫度50℃，提取時間4 h，在此條件下，總黃酮提取率可達4.12%。同時泥蒿葉總黃酮提取液總抗氧化能力相當于相同質量濃度VC的50%，而羥基自由基清除能力較強，是相同質量濃度VC的1.4～2.7倍，對科學利用泥蒿資源，發展高附加值的泥蒿產業具有參考價值和應用前景。

[1]林有潤.中國植物志（第76卷，第2分冊）[M].北京：科學出版社，1991：87-117.

[2]邵增龍，黃和平，高山林.蘆蒿研究進展[J].海峽藥學，2010，22（1）：67-69.

[3]付明，牛友芽，胡興，等.藜蒿成分及開發利用[J].安徽農業科學，2008，36（7）：2803-2804，2929.

[4]張健，林玉英，孔令義.蔞蒿的化學成分研究[J].中草藥，2004，35（9）：979-980.

[5]涂宗財，毛沅文，李志，等.野生藜蒿葉中黃酮類化合物的提取工藝[J].南昌大學學報·工科版，2011，33（3）：234-238.

[6]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海科技出版社，1997：2008-2011.

[7]楊安樹，鄧丹雯，鄭功源.藜蒿中黃酮類物質抗氧化作用的研究[J].食品科學，2003，24（7）：67-70.

[8]鄭功源，陳紅兵，鄧丹雯，等.藜蒿提取物抑菌作用的初步研究[J].天然產物研究與開發，1999，11（3）：72-76.

[9]YAO L H,JIANG Y M,SHI J,et al.Flavonoids in food and their health benefits[J].Plant Food Hum Nutr,2004,59(3):113-122.

[10]王毓寧，陳和平，馮作山.超聲波-乙醇法提取蘆蒿總黃酮的工藝研究[J].江蘇農業科學，2007（5）：215-217.

[11]魏鳳玉，王欣.纖維素酶-乙醇協同提取黃芩總黃酮[J].天然產物研究與開發，2014，26（4）：575-578.

[12]劉海鷗，虎春艷，趙聲蘭，等.滇黃芩總黃酮酶解超聲提取工藝及抗氧化活性研究[J].中國釀造，2016，35（1）：110-114.

[13]向福，付建強，胡淇淞，等.響應面法優化大別山松針黃酮的提取工藝[J].河南農業科學，2015，44（9）：145-149.

[14]黃鳳婷，馬永良，林春穎，等.酶法輔助提取南板藍葉中靛玉紅的工藝研究[J].安徽農業科學，2012，40（26）：12866-12867，12879.

[15]楊海濤，曹小燕.酶-超聲輔助提取苦蕎稈中總黃酮及抗氧化活性研究[J].中國釀造，2016，35（9）：72-76.

[16]蔣益虹.荷葉黃酮的乙醇提取工藝優化研究[J].農業工程學報，2004，20（4）：168-171.

[17]扶慶權，侯佩，柳閩生，等.蔞蒿葉總黃酮的響應面法優化微波輔助提取工藝及其抗氧化活性研究[J].食品工業，2014，35（2）：139-143. [18]呂麗爽，黃健花，周慶，等.蘆蒿中黃酮類化合物提取工藝研究[J].食品工業科技，2002，23（9）：48-49.

[19]SHI F,JIA X,ZHAO C,et al.Antioxidant activities of various extracts fromArtemisisa selengensisTurcz(LuHao)[J].Molecules,2010,15(7): 4934-4946.

[20]ZHANG L,TU Z C,YUAN T,et al.Solvent optimization,antioxidant activity,and chemical characterization of extracts fromArtemisia selengnesisTurcz[J].Ind Crop Prod,2014,56:223-230.

[21]ZHANG L,TU Z C,WANG H,et al.Metabolic profiling of antioxidants constituents inArtemisia selengensisleaves[J].Food Chem,2015,186: 123-132.

[22]ZHANG L,TU Z C,WANG H,et al.Antioxidant activity and phenolic acids profiles ofArtemisia selengensisTurcz extracted with various methodsbyHPLC-QTOF-MS/MS[J].J Food Biochem,2016,40(4):603-612.

Optimization of enzyme extraction conditions of total flavonoids fromArtemisia selengensisleaves and its antioxidant activity

CHEN Yao1,WU Longyue1,XIANG Fu1,2*,CAO Peipei1,XIANG Ruifu1,FANG Yuanping1,2
(1.College of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huanggang 438000,China; 2.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains,Huanggang 438000,China)

Using theArtemisia selengensisleaves in the Dabie Mountain area as raw material,the total flavonoids was extracted by enzyme-assisted extraction.Based on the single factor and orthogonal experiments,the enzyme extraction process conditions of total flavonoids fromA.selengensis leaves were optimized,and the antioxidant activities of total flavonoid extracts were discussed.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids were cellulase addition 3%,ethanol concentration 40%,solid-liquid ratio 1∶10(g∶ml),extraction temperature 50℃and time 4 h.Under the conditions,the extraction rate of total flavonoids was 4.12%.In addition,with the same mass concentrations,the total antioxidant activity of total flavonoids extracts fromA.selengensisleaves was 50%of that of VC,the hydroxyl free radical scavenging ability was 1.4-2.7 times of that of VC,which revealed that the total flavonoids fromA.selengensleaves had strong antioxidant activity.

Artemisia selengensisleaves;total flavonoids;enzyme extraction;antioxidant activity;hydroxyl free radical scavenging ability

R284.2

0254-5071（2017）06-0142-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.029

2017-02-20

大學生創新培育項目（sgpx201602）

陳瑤（1995-），女，本科生，研究方向為天然產物提取。

*通訊作者：向福（1977-），男，教授，博士，研究方向為天然植物資源利用。