不同株系赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性研究

張俊杰，楊旭，焦健，陳錦永，何培新，遲雷，張文葉，劉崇懷*

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南鄭州450002；3.中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

不同株系赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多樣性研究

張俊杰1，2，3，楊旭1，焦健3，陳錦永3，何培新1，遲雷1，張文葉1，劉崇懷3*

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南鄭州450002；3.中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

通過采用富集分離方法，從3個赤霞珠株系（R5、ISV-FV5和169）的葡萄果實表皮共分離得到酵母菌36株。利用26S rDNA的D1/D2和5.8S-ITS區序列分析并結合形態學特征對這些菌株進行了多樣性研究。共鑒定出3個酵母菌屬的4個已知種群，分別為Cryptococcus magnus、Cryptococcus uzbekistanensis、Rhodosporidiobolus ruineniae和Hanseniaspora uvarum。Hanseniaspora uvarum為株系R5所特有，Cryptococcus uzbekistanensis和Rhodosporidiobolus ruineniae為株系ISV-FV5所特有，而Cryptococcus magnus同時存在于株系ISV-FV5和169上。結果表明，不同株系的赤霞珠葡萄表皮蘊含著多種類型的酵母菌資源，而且盡管其生長的客觀條件是一致的，但因為株系的不同其所含酵母菌種群的組成上也存在明顯的差異。

赤霞珠；酵母菌；26S rDNA D1/D2；5.8S-ITS；多樣性

由于葡萄酒獨具的營養滋補作用、醫學作用（如延緩衰老、預防心腦血管疾?。?、預防癌癥、美容養顏作用及文化熏陶的作用，使得近年來葡萄酒在我國國內需求不斷增長，我國成為了世界上葡萄酒消費增長最快的市場。到2015年，我國葡萄栽培面積已經達到77.9 khm2，葡萄產量達到1 367萬t，葡萄酒年產量114萬kL，已經成為世界矚目的葡萄生產第一大國。中國葡萄酒產區主要集中于北緯38～53°之間的黃金帶上，由東向西，梯次布局，如渤海灣產區、沙城產區、清徐產區、黃河故道產區等。從葡萄的品種看，赤霞珠、蛇龍珠、美樂和霞多麗是中國各大產區比較普遍種植的葡萄品種[1-2]。

影響葡萄酒風味的原因主要有3個，即釀酒原料（釀酒葡萄）、釀造工藝以及發酵過程中微生物的代謝，其中以微生物的代謝影響最為重要，菌種的差異決定了風味物質的含量與種類[3]。葡萄酒的發酵過程是一個復雜的微生物參與的生物化學變化過程，酵母菌是發酵過程的主導微生物[4]。在葡萄酒生產中，酵母作為主要的發酵微生物不僅對葡萄酒產量、質量和發酵生產管理影響很大，而且對葡萄酒特色和風格的形成有重要貢獻[5]。葡萄酒發酵過程中的大多數酵母來自果皮，僅有少數來自空氣。葡萄表面的野生酵母是最豐富的。成熟葡萄裂果流汁，促使酵母繁殖，因此成熟葡萄果粒表面附生大量酵母菌。果皮蠟質有助于這些酵母菌的附著，因此葡萄果粒破碎后不久酵母就會大量繁殖，出現自然發酵現象[6]。葡萄酒中重要的香氣物質（如揮發酸、酯類、高級醇等）的組成與含量比例都與酵母菌有密切關系[7-8]。

在傳統葡萄和葡萄酒產區，酵母菌適應了當地的氣候、土壤、葡萄品種，以及自然選擇的作用，逐漸形成了適應當地葡萄酒的菌系。所以，傳統葡萄釀酒園區釀出的美酒，與商業化相比，具有很強的產區風格和地方特性[5]。目前我國在葡萄酒酵母的研究和利用方面發展還遠不如生產方面的發展迅速，葡萄酒生產所用菌種大部分依賴進口，造成在品種和風格上比較單一，地域特色不突出[9-10]。目前，大部分的研究都是對于一種葡萄的酵母資源所做的研究，對不同株系的同一品種的葡萄酵母資源研究鮮有報道。

國外對酵母資源的研究，早期以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主。近年來，葡萄釀酒酵母菌的研究不再局限于釀酒酵母，非釀酒酵母的釀酒特性研究、生物多樣性研究及分類鑒定逐漸成為國外近年來的研究熱點[11]。我國對釀酒葡萄相關酵母菌多樣性的研究報道較少。楊美景[11]從昌黎葡萄產區141個菌源樣品中分離到2 101株酵母菌；李新菊[12]從新疆石河子葡萄園的優質葡萄“霞多麗”自然發酵汁中分離出5株酵母菌；張春芝等[13]從寧夏產區的葡萄園土壤、葡萄果實表皮已經葡萄酒發酵過程中獲得729株野生酵母菌，最終確定為16個酵母類型；凌云[14]從昌黎產區以赤霞珠葡萄果粒為材料，分離出33株酵母菌，最終獲得優異菌株CLY03和CLY04。

河南省境內目前在葡萄屬（Vitis viniferaL.）植物發現了14個種、1個亞種及1個變種[15]。本研究以中國農業科學院鄭州果樹所葡萄資源圃中不同株系的釀酒葡萄“赤霞珠”成熟果實新鮮表皮為原料，對酵母菌進行富集分離和多樣性研究（WL表型鑒別和26S rDNA D1/D2區段及5.8S-ITS區測序和系統發育分析[16]），初步比較了不同株系赤霞珠葡萄表皮所蘊含酵母菌種群的組成差異。本研究對赤霞珠葡萄不同株系果皮酵母菌組成的認識，對葡萄酒制作過程中對釀酒葡萄的選擇具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

葡萄原料采自鄭州果樹研究所葡萄種質資源圃，選擇赤霞珠葡萄共3個不同的株系（R5、ISV-FV5和169，分別用1、2和3表示）的成熟果實各三串（由于葡萄種質資源圃一株葡萄的數量很少，所以每株只選取了3串）。采集當天運回實驗室，于無菌條件下從每個株系的三串葡萄平均取葡萄表皮并混合作為該株系的菌種富集出發材料，直接搖瓶發酵。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基、WL培養基：北京雙旋微生物培養基制造廠。

1.1.3 主要試劑

Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（酵母）、26SrDNA引物：NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）、NL-4（5'-GGT CCG TGT TTCAAG ACG G-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化安泰公司；LRH-250生化培養箱：中興科技有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療器械有限公司；TCL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；C1000聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國伯樂公司；JY04S-3C凝膠成像系統：上海精密科學儀器有限公司；FD-4new真空干燥機：鄭州沃邦儀器設備有限公司；DH-600型電熱恒溫振蕩培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；BL3-DYY-6C電泳儀：西化儀（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄皮酵母菌富集、分離及純化

在滅過菌的50 mL YEPD液體培養基的三角瓶中無菌條件下加入10顆葡萄漿果表皮，同時加入200 μL氯霉素（10 mg/mL）溶液（抑制細菌生長），每個株系做3組。在搖床中180 r/min，28℃條件下培養48 h。

用1 000 μL移液器吸取酵母富集液1 mL，加入9 mL無菌水試管中，旋渦振蕩混勻，制成10-1酵母菌懸液，標上記號。按照上述方法依次稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8酵母菌稀釋液。

用200 μL移液器取200 μL上述梯度稀釋的酵母菌懸液滴加在YEPD固體培養基平板（加入氯霉素）上，用涂布棒涂布均勻，每個梯度平行涂布兩個平板。涂布好的平板放置在恒溫培養箱中28℃條件下培養3 d。結合挑取YEPD培養基上不同形態的選取10～20個菌落保藏，在新的YEPD平板上3次劃線純化，并倒置培養在恒溫培養箱中28℃條件下培養3 d。

1.3.2 WL培養基表型鑒定及代表菌株的顯微形態觀察

挑取YEPD平板上的酵母菌單菌落，在WL培養基上3次劃線并倒置于恒溫培養箱中28℃條件下培養5 d。然后，根據菌落表型的差異，對供試菌進行初步分類并挑選代表菌株進行顯微形態的觀察。顯微形態觀察在光學顯微鏡下進行，采集代表菌株的顯微形態照片，并做好記錄。

1.3.3 菌株的保存及菌體的收集

挑取酵母菌單菌落接種于含有3 mL YEPD液體培養基的試管中，在恒溫搖床上以180r/min的轉速，28℃的培養溫度，振蕩培養24 h。超凈工作臺內取1 mL菌液與1 mL無菌的50%甘油混勻并加入甘油管中，于-80℃冰箱冷凍保存。另取1.5 mL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，收集菌體，暫存于-20℃冰箱中。

1.3.4 酵母菌的分子生物學鑒定

（1）代表菌株DNA的提取

按照Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒的說明提取酵母菌基因組DNA，并在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測提取DNA的質量。

（2）26S rDNA Dl/D2區段的擴增及測序

使用正向引物NL1（5′-GCATATCGGTAAGCGGAG GAAAAG-3′），反向引物NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAG ACGG-3′）進行26SrDNADl/D2區段的聚合酶鏈反應（PCR）擴增。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min，然后94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s，循環次數35次，最后，72℃延伸8 min。PCR反應液組成（30 μL體系）：每管中PCR緩沖液（10×）3.0 μL；25 mmol/L MgCl21.8 μL；2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside，dNTP）2.4 μL；10 μmol/L引物各0.6 μL；5 U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，模板DNA 1μL；最后添加ddH2O定容至30μL。

（3）5.8S-ITS區段擴增[17]

使用正向引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和反向引物ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）進行5.8S-ITS區基因擴增。PCR循環次序為：95℃預變性5min，95℃變性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，循環次數35次，最后，72℃延伸10 min。PCR反應液的組成（50 μL體系）：每管中含PCR緩沖液（10×）5.0μL；25mmol/L MgCl26.0 μL；10 mmol/L dNTP 1.0 μL；10 μmol/L引物各2.5 μL；0.5 U/μLTaqDNA聚合酶4 μL，l0 ng/μL～l μg/μL模板DNA 1.0 μL；最后添加ddH2O定容至50 μL。

（4）PCR反應產物的電泳檢測：

取2 μL PCR產物與1 μL 10×上樣緩沖液混合，點樣到1%的瓊脂糖凝膠（已加入Goldview I型核酸染液）點樣孔里，打開電源開關，電壓調至100 V，電泳時間約20 min，用紫外分析儀觀察電泳結果，初步判斷擴增片段的質量和大小，擴增合格的PCR產物送往公司測序。

（5）PCR產物測序及系統發育分析

測序結果采用MegA6軟件進行序列校正，校正后的26S rDNA D1/D2區序列及5.8S-ITS區段序列在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology infor mation，NCBI）數據庫中進行同源序列比對（BLAST）。獲得同源酵母菌株的相應序列后，用MEGA6軟件的ClustalW功能對所有供試序列進行匹配排列，然后采用Kimura 2-parameter模型構建鄰接法（neighbor-joining，N-J）系統發育樹，該分析進行1 000次的Bootstraps檢驗。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的形態學觀察及初步聚類分析

2.1.1 葡萄表皮酵母菌的分離、純化與保藏

通過YEPD液體培養基的富集及固體培養基平板的分離和純化，一共從供試3個株系的葡萄表皮分離純化和保藏酵母菌菌株36個。

2.1.2 酵母菌的菌落形態、顯微觀察及初步聚類分析

根據36株酵母菌菌株在WL培養基上的表型特征，一共得到6種表型，然后，通過對每個表型代表菌株的顯微形態觀察，共得到3種顯微形態，結果見圖1。詳細的菌株菌落形態及顯微形態描述見表1。

圖1 各類型代表菌株在WL培養基上的菌落特征(左)和顯微細胞特征(右)Fig.1 Colony characteristics(left)and microscopic cell characteristics(right)of the representative strains from different types on WL medium

表1 酵母菌基于WL培養基的表型聚類結果Table 1 Clustering analysis of yeast strains on WL medium based on phenotypes

2.2 酵母菌代表菌株26S rDNA D1/D2區段的PCR鑒定

2.2.1 酵母菌代表菌株26S rDNA D1/D2區段的PCR擴增分析

分別從以上6類菌株中挑選代表菌株（101、104、111、115-2、119、203、205、207、209、303、308）進行DNA的提取和26S rDNA D1/D2區段的PCR擴增，擴增產物的凝膠檢測結果見圖2，目的區段大小約600 bp。

圖226S rDNA D1/D2區段PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of 26S rDNA D1/D2 region of PCR products

2.2.2 26S rDNAD1/D2區段PCR擴增產物的測序與分析

得到的PCR產物送測序公司進行序列測定，得到的序列結果首先在NCBI主頁（www.NCBI.nlm.nih.gov），利用BLAST功能與Genbank數據庫里的已知序列進行同源比對。選擇同源性最高的菌株，一般為99%～100%，然后，選用Mega 6軟件進行序列的系統發育分析，建立N-J系統發育樹，結果見圖3。

圖3 代表菌株26S rDNA D1/D2區段的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 26S rDNA D1/D2 for the representative strains

由圖3可知，菌株202與Rhodosporidiobolus ruineniae聚為一個分支，序列相似性為100%，所以菌株202可以被鑒定為Rhodosporidiobolus ruineniae。菌株203和205與Cryptococcus uzbekistanensis聚為一個分支，序列相似性為100%，因而菌株203和205可以被鑒定為Cryptococcus uzbekistanensis。代表菌株101、104、111、115-2和119與Hanseniaspora uvarum聚在一起，序列相似性為100%，因而被鑒定為Hanseniasporauvarum。而代表菌株207、209、303和308與3個已知酵母菌種群Cryptococcusmagnus、Filobasidium floriforme和Filobasidiumelegans聚為一個分支，且相似性均為100%，這與劉愛國等[17]的研究結果一致，C.magnus、F.magnus和F.floriforme具有完全相同的Dl/D2區域序列，僅依靠26S rDNA D1/D2區序列分析不能區分這幾個種。因此，對于26S rDNA序列分析不能確認的菌株207、209、303和308，進行5.8S-ITS區擴增，經BLAST分析及5.8S-ITS區序列相似性計算，與菌株207、209、303、308的5.8S-ITS區序列相似性最大的酵母菌種群為Cryptococcus magnus，且相似性為100%，結果見表2，這幾個代表菌株最終被歸為Cryptococcusmagnus，也體現了5.8S-ITS區段在酵母菌種群鑒定中的作用。

表2 供試菌株5.8S-ITS序列與相關菌株的序列相似性Table 2 5.8S-ITS of the sequenced strain and the identity withrelated yeast strain

3 結論

本研究選取鄭州果樹研究所的3個不同株系的赤霞珠葡萄，通過富集和分離共得到36個菌株，最終供試菌被鑒定為3個已知酵母菌屬的四個不同的種群Cryptococcus magnus、Cryptococcus uzbekistanensis、Hanseniaspora uvarum和Rhodosporidiobolusruineniae。Hanseniaspora uvarum為株系R5所特有，Cryptococcus uzbekistanensis和Rhodosporidiobolus ruineniae為株系ISV-FV5所特有，而Cryptococcus magnus同時存在于株系ISV-FV5和169上，其中，酵母種群Rhodosporidiobolus ruineniae在過去的研究中鮮有報道。由此可見，株系ISV-FV5表皮酵母菌具有相對豐富的多樣性，而株系R5和169的表皮酵母菌組成較為單一。前期研究中還發現來自同一采樣點同一采樣時間獲得的四個不同株系梅鹿輒葡萄表皮含有6種酵母菌，其中Filobasidium floriforme是四個品種所共有的酵母菌種群，而Sporidiobolusruineniae和Hanseniaspora vineae僅為一個株系所獨有，而Rhodotorulagraminis則為兩個株系所共有，由于四個株系都來自同一個品種且種植的客觀環境一致，它們果皮都含有酵母菌種群Filobasidium floriforme，但是由于株系本身的不同，又分別含有不同于其他株系的特殊的酵母菌種群[18]。而本研究中，僅在株系ISV-FV5和169上發現了共同含有的酵母菌種群Cryptococcus magnus，但是三個株系并沒有共同的酵母菌種群，并且該研究從赤霞珠葡萄表皮分離得到的酵母菌種群與之前研究中從梅鹿輒葡萄表皮分離得到的酵母菌種群組成也完全不同，這也反映了葡萄品種差異所帶來的果皮酵母菌組成的巨大差異。

本研究中還發現屬于同一個種群的菌株其形態特征也具有顯著的差異，如類型Ⅰ、類型Ⅱ和類型Ⅲ，雖然形態特征不一樣，但是經過分子生物學方法發現都屬于Hanseniaspora uvarum。酵母菌種類和表型分析結果不完全一致，這與前期的研究結果相一致[19]，所以僅僅依靠傳統的鑒定方法是遠遠不夠的。只有把傳統的鑒定方法與現代分子生物學鑒定方法相結合，才可以更加有效而準確的對未知酵母菌菌株進行分類鑒定。

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Biodiversity of yeast strains on grape surface from different Cabernet Sauvignon clones

ZHANG Junjie1,2,3,YANG Xu1,JIAO Jian3,CHEN Jinyong3,HE Peixin1,CHI Lei1,ZHANG Wenye1,LIU Chonghuai3*
(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China; 2.Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety of Henan Province,Zhengzhou 450002,China; 3.Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,China)

With enrichment and isolation methods,36 yeast strains were obtained from grape surface of three different Cabernet Sauvignon(R5, ISV-FV5 and 169).The biodiversity of the yeast strains were studied by 26S rDNA D1/D2 domain,5.8S-ITS region sequence analysis and morphological analysis.4 species from 3 genera were recognized,includingCryptococcus magnus,Cryptococcus uzbekistanensis,Rhodosporidiobolus ruineniae and Hanseniaspora uvarum.In addition,H.uvarumwas only found from the clone R5,bothC.uzbekistanensisandR.ruineniaewere only isolated from clone ISV-FV5,whileC.magnuswas found from both clones ISV-FV5 and 169.The results showed that different Cabernet Sauvignon clones consisted diverse yeast species from the grape surfaces.However,though the three clones from the same grape variety were growing under similar objective conditions,the compositions of yeast species on grape surfaces from different clones were obviously different.

Cabernet Sauvignon;yeast;26S rDNA D1/D2;5.8S-ITS;diversity

TS261.1

0254-5071（2017）06-0126-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.026

2017-04-07

國家現代農業產業技術體系建設專項資金項目（CARS-30-yz-1）；河南省自然科學基金項目（162300410330）；鄭州輕工業學院博士科研基金項目（2014bsjj006）；鄭州輕工業學院研究生科技創新基金項目（2016）；河南省科技攻關計劃項目（142102110061）

張俊杰（1984-），講師，博士，研究方向為微生物分類與分子生態學。

*通訊作者：劉崇懷（1965-），男，研究員，博士，研究方向為葡萄遺傳育種。