富含谷氨酸釀酒酵母的篩選及發酵培養基優化

劉立聰，胡依雯，王志，代俊，李欣，姚娟，鄭國斌，呂正波，陳雄*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院發酵工程教育部重點試驗室工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢430068；2.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點試驗室，湖北宜昌443003，3.安琪酵母（德宏）有限公司，云南德宏678400）

富含谷氨酸釀酒酵母的篩選及發酵培養基優化

劉立聰1，胡依雯1，王志1，代俊1，李欣1，姚娟2，鄭國斌2，呂正波3，陳雄1*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院發酵工程教育部重點試驗室工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢430068；2.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點試驗室，湖北宜昌443003，3.安琪酵母（德宏）有限公司，云南德宏678400）

從農家自釀葡萄酒中篩選出一株富含谷氨酸釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）F-5，其26S rDNA核苷酸序列與S.cerevisiaeTY12的26S rDNA核苷酸序列同源性為100%。以胞內谷氨酸含量為目標，采用響應面法對其發酵培養基進行了優化，建立糖蜜、工業蛋白胨和KH2PO4的二次回歸模型，確定培養基最佳配方為：糖蜜（含30%蔗糖）100 mL/L、酵母浸粉10 g/L、工業蛋白胨20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L。在此優化培養基中發酵培養24 h，胞內游離谷氨酸達到了3.29%，比優化前提高了87.8%。

釀酒酵母；胞內游離谷氨酸；發酵培養基；響應面法

隨著生活水平的提高，營養功能單一的味精作為第一代增鮮調味品，與人們對食品營養和風味的高層次需求存在差距。因此，作為加強供給側結構性調整的新型調味品——酵母抽提物應運而生[1-2]。酵母抽提物作為一種正在快速發展的調味品，其研制與應用已經越來越受到人們關注[3-4]；酵母抽提物是通過發酵工程技術高效率獲得釀酒酵母細胞，并將胞內的蛋白質、核酸等進行降解后精制而成的天然調味料。主要成分為多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族維生素及微量元素，相比于味精具有純天然、營養豐富、味道醇厚等諸多優點[5]。

釀酒酵母是生產酵母抽提物的主要原料，含有18種以上氨基酸的酵母抽提物，雖然總體呈味比味精強，但是存在鮮度不突出的缺點[6-7]，而酵母抽提物中谷氨酸的含量不足是其主要原因。因此開展富谷氨酸釀酒酵母菌種選育、發酵優化等方面的研究工作對生產高質量酵母抽提物具有重要意義和廣闊的市場前景及經濟價值[8-9]。

本研究從農家自釀葡萄酒中分離純化富含谷氨酸酵母菌株，通過26SrDNA序列分析確定為釀酒酵母，并利用響應面法優化了其發酵培養基，以期提高胞內游離谷氨酸含量，為滿足人們對食品營養和風味的高層次需求奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒：湖北農村家釀葡萄酒。

篩選培養基（孟加拉紅培養基[10-11]）：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，1/3000孟加拉紅溶液100 mL，氯霉素0.1 g，水1000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

斜面培養基：蔗糖50g/L，酵母浸粉20g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，pH 4.8～5.0，121℃滅菌20 min。

種子培養基：蔗糖100g/L，酵母浸粉20g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO41g/L，pH4.8～5.0，250mL三角瓶裝液量50mL，121℃滅菌20 min。

初始發酵培養基：同種子培養基。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器：海博迅實業有限公司醫療設備廠；DK-S22水浴鍋：上海精宏試驗設備有限公司；TG18M臺式高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養箱：天津歐諾儀器儀表有限公司；DZF-6020電熱鼓風干燥箱：重慶銀河試驗儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱、SX2-5-12高溫箱形電爐：上海博迅實業有限公司；BS110S電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國安捷倫公司；5417R型冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ZYUPH-I-10T純水儀：Millipore；DYY-7B電泳儀：北京六一儀器廠；DRC-100H/DLX-254A紫外凝膠成像系統：Gene公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

農家自釀葡萄酒搖勻，吸取5mL葡萄酒原液，接種到裝量50mL種子培養基的搖瓶中，恒溫搖床中30℃、180 r/min培養12 h備用。

1.3.2 菌種的分離純化

吸取1 mL備用樣品加入裝有9 mL無菌水的試管中，充分振蕩使菌體混勻，無菌條件下采用10倍梯度稀釋法將上清制成10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，分別取0.50 mL加入平皿中（篩選培養基，裝液量約20 mL），用涂布棒涂布均勻，30℃培養箱中培養48 h[12]。平皿中長出的單菌落進行鏡檢，對符合酵母菌特征的單菌落劃線，接種到新鮮的篩選培養基平皿中，30℃培養48 h后，采用平板劃線操作，獲取單菌落。重復以上操作，直到獲得純的菌株，并斜面保存。

1.3.3 富谷氨酸酵母菌株的篩選

將斜面菌種用接種環勾出一環在新鮮試管斜面上劃滿整個表面，30℃培養12 h，后無菌操作向每支新鮮斜面試管中倒入15 mL無菌水，洗脫表面菌體，并用移液槍吹打均勻成菌懸液，然后用移液槍轉接至250 mL三角瓶，每瓶接種量為10%（5 mL菌懸液），30℃、180 r/min搖床培養10 h。然后轉接到裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶，每瓶接種量10%（5 mL），30℃、180 r/min搖床培養18 h后取樣，樣品水洗2次后加2倍體積的去離子水重懸菌體，-20℃冷凍1 h后，80℃水浴20 min，反復凍融3次，離心取上清，用高效液相色譜檢測上清中的谷氨酸濃度，濃度高的菌株保留，反之淘汰。

1.3.4 酵母胞內谷氨酸測定

樣品預處理：取發酵培養24 h后的發酵液2.5 mL，6 500 r/min離心5 min倒掉上清，水洗菌體2次，再用5 mL去離子水重懸菌體，-20℃凍1 h，后80℃水浴15 min，反復凍融3次[13]。凍融好的菌懸液6 500 r/min離心5 min，取上清600 μL于2 mL離心管，再向其中加入2倍體積（1.2 mL）冰凍后的無水乙醇，10 000 r/min、4℃離心5 min，0.22 μm過濾上清得到檢測樣，-20℃條件下保存。胞內游離谷氨酸含量采用HPLC檢測[14]。

HPLC分析條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-Aq column（150 mm×4.6 mm×5 μm）；柱溫30℃；進樣量20 μL；紫外檢測波長210 nm；采用10 mol/L pH 1.8的K2HPO4（磷酸調pH）作為流動相；流速0.6 mL/min。根據所測標品，谷氨酸的保留時間為4.6 min。

1.3.5 26S rDNA基因序列分析

提取酵母菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），對獲得的總基因組DNA進行26S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，采用引物：IST1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，IST4：5′-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3′，擴增條件：預變性94℃、5 min；變性94℃、30 s；退火60℃、30 s；延伸72℃、1 min；30個循環；72℃、10 min。將PCR擴增片段回收，送至武漢鉑尚生物技術有限公司測序。將測序結果與NCBI數據庫對比，繪制進化樹，確定菌株在系統分類學上的歸屬。

1.3.6 培養基優化

以胞內谷氨酸量為指標通過單因素試驗，確定最適碳源、氮源和無機鹽的濃度，用Design Expert 8.0.6軟件2水平確定谷氨酸合成影響顯著因子，再通過爬坡試驗和響應面分析對顯著因子水平進行優化。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

通過篩選、純化、菌落形態、顯微鏡觀察（出芽生殖特點）以及菌株生長周期和產胞內游離谷氨酸的測定，從300余株菌株中獲得6株生長快、產胞內游離谷氨酸能力較強的酵母菌株（編號為F-5、A-3、F-4、B-15、E-11、A-12），其在搖瓶水平（種子培養基）發酵過程谷氨酸合成特點如圖1所示。

圖1 酵母菌胞內谷氨酸周期變化Fig.1 Periodic changes of intracellular glutamate content synthesized by yeast

由圖1可知，F-5和A-3菌株的胞內谷氨酸合成性能明顯要優于其他4株菌，其峰值濃度分別達到了1.75%和1.67%，顯著高于其他菌株。雖然24 h后F-5和A-3的谷氨酸都呈下降趨勢，但F-5菌株的下降趨勢明顯小于A-3菌株，因此，后續試驗選用F-5菌株作為試驗菌株。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株F-5 26S rDNA基因片段PCR產物擴增電泳圖

提取酵母菌基因組DNA，對獲得的總基因組DNA進行26S rDNA的PCR擴增，結果見圖2。

圖2 菌株F-5的PCR擴增產物電泳圖Fig.2 PCR electropherogram of amplified product of strain F-5

由圖2可以看出，26S rDNA基因大小約為625 bp。

2.2.2 菌株F-5 26S rDNA基因序列

菌株F-5 26S rDNA基因測序結果如下：

2.2.3 菌株F-5的26S rDNA基因發育樹

菌株F-5的26SrDNA核苷酸序列通過BLAST軟件比對后，結果顯示，其與釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）TY12的26S rDNA的核苷酸序列同源性為100%。用MEGA軟件構建系統發育樹（圖3），表明菌株F-5屬于酵母屬（Saccharomyces）的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖3 菌株F-5基于26S rDNA基因序列發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain F-5 based on 26S rDNA gene sequence

2.3 響應面分析結果

2.3.1 Plackett-Burman試驗[15]

按照Plackett-Burman試驗設計，把每個因素設計成高（+1）、低（-1）2個水平，高水平為低水平的2倍，胞內谷氨酸含量為響應值，具體試驗設計見表1，各因素及顯著性分析見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

表2 各因素水平、效應值及顯著性分析結果Table 2 Results of level of each factor,effect value and significant analysis

由表2可知，糖蜜、酵母浸粉、KH2PO4表現為負效應，蛋白胨、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O表現為正效應。可信度＞95%的因素為糖蜜，表現為極顯著。其中工業蛋白胨和磷酸二氫鉀可信度＞90%，且貢獻值排在前三位。因此確定糖蜜、工業蛋白胨、KH2PO4為主要影響因素進行下一步試驗。FeSO4·7H2O影響不顯著，后續試驗將其含量降低為2.0g/L。

2.3.2 最陡爬坡試驗結果

根據Plackett-Burman試驗找出的顯著影響因素及效應值，設計合適的步長進行最陡爬坡試驗，尋找最大產量區，試驗設計及結果見表3。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiments

由表3可知，胞內谷氨酸含量最高在第4組，因此以第4組的水平作為響應面試驗的中心點，即糖蜜為120 mL/L、工業蛋白胨為16 g/L、KH2PO4為0.7 g/L。

2.3.3 響應面分析的試驗設計與結果

據最陡爬坡試驗確定的中心點，用Design Expert 8.0.6軟件進行中心組合試驗設計，將最陡爬坡試驗中的因素分別標記為X1、X2、X3，以發酵培養24 h后收集菌體所測胞內谷氨酸含量為響應值，標記為Y，中心組合試驗因素變量及水平見表4，試驗設計及結果見表5，方差分析見表6。

表4 中心組合試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of center composite experiments

表5中心組合試驗設計數據及結果通過Design Expert 8.0.6軟件響應面分析程序進行二次多項回歸擬合，獲得3種顯著影響因子與胞內谷氨酸含量的二次多項式回歸模型方程：Y=2.75-0.067X1-6.024×10-3X2-0.013X3-0.040X1X2+ 0.033X1X3+2.500×10-3X2X3+0.16X12+0.13X22+0.10X32

表5 中心組合試驗設計及結果Table 5 Design and results of center composite experiments

由表6可知，模型大于F值的概率P＜0.01，表明模型非常顯著，對響應值Y影響也非常顯著，可信度較高；模型的二次項X12、X22、X32對胞內谷氨酸含量的影響非常顯著（P＜0.01），模型失擬項（Lack of Fit）的P值為0.387 5，表明模型選擇合適，可以用此模型對釀酒酵母產胞內谷氨酸的量進行分析與預測。

表6 回歸方程方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

2.3.4 最佳濃度的確定及驗證試驗

根據上述回歸方程繪出響應面分析圖，以確定3個因素對胞內谷氨酸含量的影響，響應面圖見圖4。由圖4可知，響應面分析圖的曲面開口向下，說明二次項回歸方程存在最大值。由Design Expert8.0.6軟件分析得到最適培養基中糖蜜、工業蛋白胨、磷酸二氫鉀所對應的實際值分別為100mL/L、20 g/L、0.5 g/L。即最適培養基組成為：糖蜜100 mL/L、酵母浸粉10 g/L、工業蛋白胨20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L。將該組合帶入上述二次多項式回歸模型方程，預計釀酒酵母胞內谷氨酸含量達3.289%。利用上述最適培養基進行搖瓶驗證試驗，釀酒酵母搖瓶發酵24 h后取樣檢測胞內谷氨酸含量達到3.29%，比優化前發酵配方（1.75%）提高了87.8%，與模型預測結果相吻合。

圖4 糖蜜、工業蛋白胨和KH2PO4交互作用對胞內谷氨酸含量影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between molasses,industrial peptone and KH2PO4on intracellular glutamate contents

3 結論

從家釀葡萄酒中分離得到一株富谷氨酸釀酒酵母菌株F-5，在初始發酵培養基上，胞內谷氨酸含量最高達到1.75%。考慮到工業生產以糖蜜作為主要碳源，因此確定在以糖蜜作為主要碳源的基礎上，利用響應面法優化菌株J-5最適發酵培養基為：糖蜜（含30%蔗糖）100 mL/L、酵母浸粉10g/L、工業蛋白胨20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L。在此優化培養基中發酵，胞內游離谷氨酸達到了3.29%，比優化前提高了87.8%。為生產高品質酵母抽提物奠定了基礎。

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Screening ofSaccharomyces cerevisiaewith high glutamic acid content and optimization of fermentation medium

LIU Licong1,HU Yiwen1,WANG Zhi1,DAI Jun1,LI Xin1,YAO Juan2,ZHENG Guobin2,LV Zhengbo3,CHEN Xiong1*
(1.Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Key Laboratory Fermentation Engineering(Ministry of Education),College of Food and Bioengineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;2.Hubei Province Key Laboratory of Yeast Function,Angel Yeast Co.,Ltd.,Yichang 443003,China;3.Angel Yeast(De Hong)Co.,Ltd.,Dehong 678400,China)

ASaccharomyces cerevisiaeF-5 with high glutamic acid content was screened from home-made wine.The homology of its 26S rDNA sequence with the 26S rDNA sequence ofS.cerevisiaeTY12 was 100%.Using the intracellular glutamate content as evaluation indexes,the fermentation medium of the strain F-5 was optimized by response surface methodology,and quadratic regression model of molasses,industrial peptone and KH2PO4was established.The optimum formula of fermentation medium were determined as follows:molasses(30%sucrose)100 ml/L,yeast extract powder 10 g/L,industrial peptone 20 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,K2HPO40.5 g/L,and FeSO4·7H2O 2 g/L.The content of intracellular free glutamate was up to 3.29%under the optimum medium at 24 h,which was 87.8%higher than that of before optimization.

Saccharomyces cerevisiae;intracellular free glutamate;fermentation medium;response surface methodology

Q815

0254-5071（2017）06-0116-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.024

2017-02-17

劉立聰（1991-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：陳雄（1969-），男，教授，博士，研究方向為釀造工程。