發酵型核桃乳生產專用乳桿菌的選育

趙娟娟，吳榮榮，程書梅

（1.衡水學院生命科學系，河北衡水053000；2.河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

發酵型核桃乳生產專用乳桿菌的選育

趙娟娟1，吳榮榮1，程書梅2

（1.衡水學院生命科學系，河北衡水053000；2.河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

從發酵面包、白芥絲、泡菜、酸菜中分離到14株乳桿菌，經核桃乳發酵產酸特性初篩，確定菌株L5、L7、L8及L12適合核桃乳發酵。通過菌落形態、菌體形態和16S rRNA基因序列分析，確定4株菌分別為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。將上述菌株與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發酵實驗，感官評分分別為78分、95分、83分和82分；4個發酵核桃乳中9種氨基酸含量均有不同程度提高，其中菌株L7發酵產品的氨基酸含量增幅最大，由0.67%增至1.60%。因此副干酪乳桿菌L7更適合發酵型核桃乳的生產。

發酵型核桃乳；乳桿菌；分離；鑒定

核桃仁營養成分豐富，其中主要成分是脂肪、蛋白質和碳水化合物，此外還含有豐富的膳食纖維、維生素及礦物質元素。核桃乳是以核桃仁為原料經浸泡、磨漿、過濾、均質、殺菌后制成的植物蛋白飲品[1-2]。

核桃乳在乳酸菌的發酵過程中，能使其中的蛋白質分解，且礦物質、肽、氨基酸、B族維生素等物質含量增加，可提高腸胃的消化吸收率[3-5]；同時乳酸菌的產香、產酸特性，使得發酵型核桃乳的風味更加濃厚，形成適口、風味獨特的飲品，增加了產品的腸道保健功能[6-8]。

本研究從不同來源的植物材料中，分離適合核桃乳發酵的乳桿菌，并對菌株進行形態和16S rRNA基因序列，確定其分類地位，最后進行核桃乳發酵實驗，確定最佳乳桿菌菌株。以期為發酵核桃乳的生產提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）SA：從發酵面包中分離得到，保存于衡水學院微生物實驗室。

乳桿菌：從發酵面包、白芥絲、泡菜、酸菜等食品中分離。

MRS培養基：大豆蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉5.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，K2HPO4·7H2O 2.0 g/L，三水醋酸鈉5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MnSO4·4H2O0.05g/L，瓊脂粉15.0g/L。pH6.2，分裝后121℃高壓滅菌15～20 min，固體培養基需加入瓊脂1.3%～1.5%。

番茄汁瓊脂（tomato juice agar，TJA）培養基：番茄汁50.0g/L，酵母膏5.0g/L，牛肉膏10.0g/L，葡萄糖2.0g/L，乳糖20.0g/L，乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L。pH6.6～7.0，121℃滅菌15 min，固體培養基需加入瓊脂1.3%～1.5%。

1.2 儀器與設備

TakaraThermalCyclerDiceTP600聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：日本TaKaRa公司；Mupid電泳儀：美國Major Science公司；ImageMaster VDS電泳成像裝置：安發瑪西亞生物技術公司；ABIPRISM3730XLDNASequencer脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）測序儀：美國應用生物系統公司；DM3000顯微鏡：德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌的分離純化

上述植物源產品過濾后吸取1 mL（面包為1 g），用無菌生理鹽水10倍稀釋至10-5、10-6和10-7。取0.1 mL稀釋后樣品均勻涂布在MRS培養基上，37℃倒置培養48 h，劃線法分離純化獲得菌株。經鏡檢為純培養物后轉入固體斜面上，一部分于甘油保存，一部分在4℃冰箱中保存[9-11]。

1.3.2 乳桿菌的形態特征

將分離的菌種接種在MRS培養基上，37℃恒溫箱中培養48h，觀察菌落的形態。菌株進行革蘭氏染色后用油鏡觀察菌株的形態[12-13]。

1.3.3 乳桿菌的16S rRNA基因序列分析

將乳桿菌的培養液使用TakaraMiniBEStBacteriaGenomic DNA ExtractionKitVer.2.0（Code No.DV810A）試劑盒進行基因組DNA的提取，取1μL進行瓊脂糖凝膠電泳。以基因組DNA為模版，使用Takara16SrRNABacterialIdentificationPCR Kit（CodeNo.D310）擴增，以特異性引物，乳桿菌L1目的片段，取5μL進行瓊脂糖凝膠電泳。使用TakaraAgaroseGelDNA PurificationKitVer.2.0（CodeNo.DV805A）切膠回收目的片段，取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。回收產物在寶生物工程有限公司測序，測序結果在GeneBank中利用Blast程序進行比對。

1.3.4 核桃乳的發酵工藝流程

1.3.5 測定方法

發酵核桃乳感官評價：以色澤、香氣、滋味及形態作為核桃乳感官評分指標，邀請10人進行試飲評判。評分結果取其平均值計算[14-15]，滿分100分，感官評分標準見表1。

表1 發酵核桃乳感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of fermented walnut milk

氨基酸含量采用氨基酸自動分析儀進行檢測。酸度測定：取乳樣10 mL，加入20 mL蒸餾水和2～3滴酚酞試劑，用標定過的0.1004mol/LNaOH溶液進行滴定，酸度用吉爾涅爾度（°T）表示。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌的分離及形態特征

共采集樣品4份，從中分離得到乳桿菌14株，分別命名為L1～L14，乳桿菌形態特征見表2。代表菌株L7的細胞及菌落形態特征見圖1。

表2 乳桿菌形態特征Table 2 Morphological characteristics ofLactobacillus

圖1 菌株L7的菌體（A）和菌落形態（B）Fig.1 Mycelial(A)and colony morphology(B)of strain L7

由表2可知，來自發酵面包的乳桿菌6株，占總分離菌株的43%；來自白芥絲的乳桿菌2株，占總數的14%；來自泡菜的乳桿菌4株，占總數的29%；來自酸菜的乳桿菌2株，占總數的14%。分離后的乳桿菌主要以細長桿狀占優勢。

由圖1可知，分離得到的乳桿菌，細胞形態為桿狀，以單個或鏈狀存在，在MRS固體培養基上培養2 d后，形成乳白色圓形菌落，且表面光滑，邊緣整齊，無褶皺，直徑約1 mm。

2.2 乳桿菌的初篩

將乳桿菌L1～L14分別與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發酵實驗，產品酸度的檢測結果見表3。

表3 不同菌株發酵核桃乳酸度測定結果Table 3 Determination results of acidity in walnut milk fermented by different strains

由表3可知，經過菌株L5、L7、L8、L12制備的發酵核桃乳酸度為40～45°T，感官評價結果表明，由上述菌株制備的核桃乳酸甜適口，可作為后續研究的菌株。

2.3 乳桿菌序列分析結果

將4個菌株的16S rRNA序列提交到GenBank數據庫進行比對，結果見圖2。

圖2 菌株L5、L7、L8和L12的16S rRNA序列的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of strains L5,L7,L8 and L12

由圖2可知，菌株L5與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）CP005485.1的16S rRNA基因的相似性達到100%，結合菌體形態特征，菌株L5鑒定為鼠李糖乳桿菌；L7與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）CP007122.1的16S rRNA基因的相似性達到100%，結合菌體形態特征，菌株L7鑒定為副干酪乳桿菌；L8與食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）KJ095645.1的16S rRNA基因的相似性達到99%，結合菌體形態特征，菌株L8鑒定為食竇魏斯氏菌；L12與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）CP006690.1的16S rRNA基因的相似性達到100%，結合菌體形態特征，菌株L12鑒定為干酪乳桿菌。

2.4 發酵核桃乳感官評價結果

將乳桿菌L5、L7、L8、L12與嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發酵實驗，得到發酵核桃乳。分別為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4，感官評定結果見表4。

表4 不同菌株發酵核桃乳感官評分結果Table 4 Sensory evaluation results of walnut milk fermented by different strains

由表4可知，樣品2的感官評分結果最高，白色微顯灰色，具有核桃香氣，酸甜適口，乳酸味濃厚且柔和，均勻一致。

2.5 發酵核桃乳氨基酸含量

將乳桿菌L5、L7、L8、L12與嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發酵實驗，分別為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4，氨基酸含量檢測結果見表5。

表5 不同菌株發酵核桃乳氨基酸含量檢測結果Table 5 Determination results of amino acid contents in walnut milk fermented by different strains %

由表5可知，發酵型核桃乳與未發酵的對照相比，總的氨基酸含量均有不同程度的提高，菌株L7發酵后產品氨基酸含量增幅最大，由0.67%提高至1.60%，其中賴氨酸含量提高了5倍，亮氨酸含量提高了1.5倍。賴氨酸是核桃的第一限制性氨基酸，亮氨酸有助于血糖控制，重點考慮了這兩種，綜合感官評價分數，最終選擇了菌株L7。

3 結論

本研究從特定植物來源的材料中分離得到了L5、L7、L8、L12四株乳桿菌。通過菌落形態、菌體形態和16S rRNA基因序列分析，分別鑒定為鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、食竇魏斯氏菌、干酪乳桿菌。將上述菌株與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發酵特性試驗，結果表明，采用菌株L7與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA發酵得到的發酵核桃乳感官評價最佳，且具有較高的營養價值，適合用在核桃乳的發酵生產中。

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Screening ofLactobacillusused for fermented walnut milk

ZHAO Juanjuan1,WU Rongrong1,CHENG Shumei2
(1.Department of Life Science,Hengshui University,Hengshui 053000,China; 2.College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

14 strains ofLactobacilluswere isolated from fermented bread,white mustard silk,pickles and Chinese sauerkraut.After preliminary screening based on acid-producing characteristics in walnut milk fermentation,4 strains(strains L5,L7,L8 and L12)which were suitable for walnut milk fermentation were determined.By colonial morphology,mycelial morphology and 16S rRNA gene sequence analysis,4 strains were identified asLactobacillus rhamnosus,Lactobacillus paracasei,Weissella cibariaandLactobacillus casei,respectively.The identified strains and laboratory preservedStreptococcus thermophilusSA were tested for the fermentation of walnut milk.The sensory evaluation score of fermented walnut milk were 78,95,83 and 82,respectively.9 kinds of amino acids contents in 4 fermented walnut milks were increased in different degrees,in which the increasing amplitude of amino acid content in the product fermented by strain L7 was the highest and increased from 0.67%to 1.60%.L.paracaseiL7 was more suitable for the production of fermented walnut milk.

fermented walnut milk;Lactobacillus;isolation;identification

TS201.1

0254-5071（2017）06-0107-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.022

2017-02-21

趙娟娟（1982-），女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術。