冰梨酒釀酒酵母的篩選

趙國群，張曉騰，趙一凡，關軍鋒*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省農林科學院遺傳生理研究所，河北石家莊050051）

冰梨酒釀酒酵母的篩選

趙國群1，張曉騰1，趙一凡1，關軍鋒2*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省農林科學院遺傳生理研究所，河北石家莊050051）

以鴨梨為原料，榨汁后經冷凍濃縮制成濃縮梨汁（即冰梨汁），接入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），在15℃下進行低溫酒精發酵釀制成冰梨酒。通過比較8株釀酒酵母的發酵性能，及其所釀冰梨酒的理化指標、有機酸含量和感官品質，最終確定釀酒酵母R2為釀制冰梨酒的適宜菌種。該酵母生長繁殖快、降糖和產酒精能力強、發酵性能優良；釀出的冰梨酒酒香和諧，果香純正，口感甜美醇厚、柔和爽口，具有冰梨酒特有的風味。

冰梨酒；釀酒酵母；酒精發酵；篩選

冰酒一般是指推遲鮮果采收時間，將其在自然低溫（-7～-10℃）條件下冰凍，然后采摘、榨汁、發酵釀成的果酒。《中國葡萄釀酒技術規范》中對冰葡萄酒的定義是：將葡萄推遲采收，在氣溫低于-7℃條件下，使葡萄在樹枝上保持一定時間，使其結冰，然后采收、壓榨，用此葡萄汁釀成的酒[1-2]。冰葡萄酒由于其獨特濃郁的醇厚甜香風味和口感，加上對原料的苛刻要求和繁復、嚴謹、漫長的發酵過程使其成為葡萄酒中的極品，更被譽為“液體黃金”[3]。借鑒冰葡萄酒的概念和釀造工藝，采用人工冷凍技術，其他果實釀制的冰酒也有了很大的發展，并已經開發出藍莓冰酒[4]、樹莓冰酒[5]、沙棘冰酒[6]和荔枝冰酒[7]等。梨果肉質細脆，含糖量高，香甜爽口，營養豐富，含有各種蛋白質、礦物質和多種維生素等，是釀造果酒的良好原料[8]。但目前鮮有冰梨酒的報道。

冰酒原料的高糖、高酸環境以及發酵過程中低溫條件要求所采用的酵母能耐高糖、耐低溫。酵母種類對冰酒發酵過程中乙酸和甘油的形成、冰酒的感官特性有顯著影響。由于高滲環境引起酵母菌的脅迫，3-磷酸甘油脫氫酶1（glycerol phosphate dehydrogenase，GPD1）和3-磷酸甘油酯酶2（glycerol phosphatase，GPP2）在短時間內誘導表達，促使代謝流轉向甘油合成途徑并在胞內積累以平衡外界滲透壓，高滲透壓也正向調節酵母菌乙醛脫氫酶活性，促使乙酸的合成，因而冰酒中甘油和乙酸含量比普通酒多[9-10]。甘油能改善改善葡萄酒的甜味、酒體與豐滿度[11]。乙酸約占冰酒中揮發酸的90%，高揮發酸會使冰酒出現腐敗味，降低冰酒的價值[12]。國內外學者對冰葡萄酒釀造菌種進行了篩選。ERASMUS D J等[13]比較了7種商品釀酒酵母的發酵性能，發現菌株R-HST、N96和EC1118產乙酸量少，適合冰葡萄酒的生產；裴廣仁等[14]比較了9種商業葡萄酒酵母，發現菌株WY3最適合冰葡萄酒生產。釀酒酵母種類對于冰酒的生產及品質至關重要，目前尚未見冰梨酒專用酵母的報道。本研究以鴨梨為原料，榨汁后經冷凍濃縮制成濃縮梨汁，接種釀酒酵母后在低溫條件下進行酒精發酵，比較不同的釀酒酵母的發酵性能及冰梨酒的理化指標和感官品質，以期篩選出一株適合于釀造冰梨酒的釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨梨：河北省趙縣產；耐低溫釀酒酵母R2、R-HST、EC1118、K1、DV10、71B：上海杰兔工貿有限公司；釀酒酵母RW：湖北安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母KD10：本實驗室保存。酵母粉、葡萄糖、蛋白胨等生化試劑：北京奧博星生物技術有限責任公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養基：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉。

1.2 儀器與設備

JYZ-E6螺桿式榨汁機：九陽股份有限公司；ZXSD-A1090生化培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；安捷倫6820高效氣相色譜儀：美國惠普公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母種子液的制備

釀酒酵母R2、R-HST、EC1118、K1、DV10、71B、RW：配制5%的葡萄糖水，以100∶1（mL∶g）比例加入干酵母粉，35℃下活化30 min。

釀酒酵母KD10：在100 mL YPD液體培養基中，接入2～3環斜面保藏的酵母菌株，在30℃、180 r/min搖床培養12 h。

1.3.2 冰梨汁的制備

選擇新鮮無病的成熟鴨梨，清水洗凈、去核后榨汁。利用不同濃度溶液的冰點不同，溶液濃度越低冰點越高，即先結冰部分溶液較稀，去除冰晶可將溶液濃縮的原理，將壓榨后的鴨梨汁放置于-18℃冰箱冷凍室中冷凍至完全結冰，然后在4℃冷藏室中進行解凍，去除冰塊，收集先溶解的部分果汁，并測定可溶性固形物含量，再放入冷凍室冷凍，然后解凍，如此重復多次，最后獲得濃縮的鴨梨汁，即為冰梨汁。經測定，冰梨汁中還原糖含量360 g/L、總酸含量3.75 g/L。

1.3.3 冰梨酒的發酵

將300 mL冰梨汁加入500 mL的三角瓶中，加入360 μL 100 g/L偏重亞硫酸鉀溶液（SO2終質量濃度60 mg/L），接入釀酒酵母種子液，接種量均為1×106CFU/mL，用8層干凈的紗布封口，在15℃生化培養箱中靜置，進行酒精發酵。定時測定發酵液中的活菌數、還原糖含量和總酸。待發酵液酒精含量約12%（體積分數）時，補180 μL 100 g/L偏重亞硫酸鉀溶液終止發酵。發酵結束后，用硅藻土過濾，所得到的澄清酒液即為冰梨酒，裝瓶后冷藏。檢測冰梨酒的理化指標及有機酸，并對冰梨酒的感官品質進行評價。

1.3.4 分析方法

（1）發酵液酵母活菌數的測定

采用平板菌落計數法測定發酵液酵母活菌數[15]。

（2）冰梨酒理化指標測定

冰梨酒的常規理化指標參照GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》進行測定。有機酸的測定：高效液相色譜法[16]；還原糖的測定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[17]；色度的測定[18]：冰梨酒經0.45 μm孔徑的濾紙過濾，置于1mm的比色杯中，在波長420nm、520nm和620nm處測定其吸光度值，分別記作A420nm、A520nm和A620nm，三者相加即為該冰梨酒色度。

（3）冰梨酒的感官評價

挑選10位具有食品評審經驗的師生組成評審小組，評分標準參照冰葡萄酒國家標準GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中的規定，主要從外觀色澤、澄清度、香氣、口味、風格幾方面進行評定，滿分100分，感官得分以平均值計。具體感官評價標準見表1。

表1 冰梨酒的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of ice pear wine

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵性能比較

2.1.1 生長能力

冰酒發酵過程中，發酵啟動時間過長，將會加大發酵醪感染雜菌的機會，并影響發酵設備的利用率，這就要求所使用的釀酒酵母在高糖、高酸及低溫條件下有較強的生長能力。一般冰葡萄汁含糖量320～360 g/L、總酸80～120 g/L[19]，而本研究所使用的冰梨汁糖含量360 g/L、總酸含量3.75 g/L，因此，冰梨汁僅是高糖而非高酸環境。對8株酵母菌株的生長能力進行檢測，結果見表2。由表2可知，8株酵母菌接種到冰梨汁后，由于受到低溫和高糖環境的影響，酵母細胞生長總體比較緩慢，但不同酵母菌株的生長能力仍有明顯的差異（P＜0.05）。菌株EC1118和K1在發酵6 d時活菌數達到最大值，而其余菌株在4 d時即達到最大值。菌株DV10的最大活菌數最高，為32.7×107CFU/mL；而菌株71B最大活菌數最低，僅為13.4×107CFU/mL，這表明菌株DV10耐低溫、耐高滲的能力最強。從酵母菌體總的生長性能進行比較可知，菌株DV10生長能力最好，其次為菌株R2、K1。

表28 株酵母菌的生長能力比較Table 2 Comparison of the growth ability of eight yeast strains

2.1.2 降糖及產酒精能力

比較8株酵母發酵冰梨汁第14天時的殘糖含量及酒精度，結果見表3。由表3可知，不同酵母菌株的降糖能力和產酒精能力有著較大的差異。菌株DV10降糖速度最快，所產生的酒精最多，表明該菌株在低溫和高滲條件下代謝轉化糖的能力和產酒精能力均較強；其次是菌株R2、RW。從表3還可看出，盡管發酵結束時冰梨酒的酒精度均達到12%vol，滿足了GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》對冰酒酒精度的要求，但8株酵母的發酵周期明顯不同。菌株DV10的發酵周期最短，僅為14 d，其原因可能與該菌株生長速度快、降糖和產酒精能力強有關；而菌株71B的發酵周期最長，達26 d。從降糖速度、產酒精能力和發酵周期角度綜合考慮，酵母發酵能力從強到弱依次為DV10＞EC1118＞R2。

表38 株酵母菌的降糖及產酒精能力比較Table 3 Comparison of the sugar-reducing and alcohol-producing capacity of eight yeast strains

2.1.3 產酸能力

果酒中的有機酸與果酒的風味有很大的關系，其不僅保持果酒的果香、降低甜度，還可以修飾其他的滋味[20]。梨汁本身含有蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、乳酸等多種有機酸。釀酒酵母在酒精發酵過程中不僅會將糖轉化為酒精，而且在其生長代謝過程還會產生蘋果酸和琥珀酸等有機酸[16]。對8株酵母菌株的產酸能力進行檢測，結果見表4。由表4可知，與未發酵的冰梨汁（總酸3.75 g/L）相比，冰梨酒的總酸大幅度增加；其中菌株R-HST發酵的冰梨酒總酸最高，達到7.50g/L，是冰梨汁總酸的2倍，而其他7株酵母發酵的冰梨酒總酸含量很接近，約為冰梨汁的1.7倍，表明這8株酵母菌均有較強的產酸能力，其中產酸最強的是菌株R-HST。

表48 株酵母菌的產酸能力比較Table 4 Comparison of acids-producing capacity of eight yeast strains

揮發酸是影響冰酒口感的重要影響因素之一，其主要化學成分是乙酸。適量的揮發酸可以增加冰酒酒體的醇厚，但是過量的揮發酸會嚴重影響冰酒的酒質與口感，甚至有令人不愉快的氣味產生[21]。普通葡萄酒中乙酸的閾值是0.2 g/L，最適濃度為0.2～0.7 g/L，在此范圍內乙酸可以增強葡萄酒香氣的復雜性，但超過0.7 g/L后，會對葡萄酒的香氣產生負面影響[22]；而冰葡萄酒中乙酸的閾值是3.18 g/L[23]。由表4可知，與未發酵的冰梨汁（揮發酸0.023 g/L）相比，冰梨酒揮發酸含量急劇增加，達到58倍以上；揮發酸中主要是乙酸，占揮發酸的95%以上。其中，菌株DV10發酵的冰梨酒中揮發酸含量最高，其次是菌株71B，而其他酵母所產揮發酸量很接近。高含量的揮發酸是冰酒酸敗的標志，國家標準GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中規定冰酒揮發酸的限量為2.1 g/L。實際上，冰酒的高揮發酸通常是由于酵母對高滲脅迫的反應，而不是細菌的腐敗作用[14]。盡管發酵后冰梨酒中乙酸含量大幅度增加，但揮發酸含量范圍為1.35～1.51g/L，均符合GB/T25504—2010《冰葡萄酒》中規定的冰酒揮發酸限量。裴廣仁等[14]篩選冰葡萄酒釀酒酵母時，發現供試酵母發酵的冰葡萄酒揮發酸含量為0.87～1.56g/L，與本試驗結果基本一致。

2.2 不同酵母發酵的冰梨酒質量指標比較

2.2.1 冰梨酒的理化指標

對8株酵母菌發酵的冰梨酒理化指標進行檢測，結果見表5。由表5可知，菌株R2和R-HST所釀冰梨酒的酒精度低于其他6株菌，但其還原糖含量較高。菌株R-HST所釀冰梨酒的總酸最高，達到了7.50 g/L；其他7株的總酸差異不顯著。就冰梨酒的揮發酸含量而言，不同酵母菌所釀冰梨酒差異較大；菌株DV10和71B的揮發酸含量較高，而菌株R2、R-HST和KD10的揮發酸含量較低。8株酵母菌所釀冰梨酒的pH值差異不顯著。葡萄酒的主體骨架是由干浸出物含量決定的，干浸出物含量越高，葡萄酒品質越好。菌株R2和71B所釀制的冰梨酒干浸出物顯著高于其他菌株。8株菌所釀制的冰梨酒在色度上有明顯的差異。菌株DV10釀制的冰梨酒色度值最高（0.65），其次是菌株EC1118（0.51），而菌株R2釀制的冰梨酒色度值最低（0.33）。8株酵母發酵的冰梨酒顏色為淺黃至褐黃色，這種顏色差異用目測即可察覺出。造成這種現象的原因可能與酵母細胞吸附冰梨酒中酚類物質能力不同有關[24]。從揮發酸、干浸出物和色度的檢測結果分析，菌株R2最適宜用來釀制冰梨酒。

表58 株酵母所釀的冰梨酒理化指標Table 5 Physicochemical indexes of ice pear wines brewed by eight yeast strains

2.2.2 冰梨酒中有機酸

有機酸的種類、含量和比例調節著果酒的酸堿平衡，影響著果酒的口感及色澤[25]。對8株酵母菌發酵的冰梨酒中有機酸進行檢測，結果見表6。由表6可知，8株菌所釀制的冰梨酒中有機酸總量比較接近。8株酵母菌發酵的冰梨酒中均含有10種有機酸，其中，除菌株DV10外，蘋果酸含量均為最高，約占總有機酸的30%左右，其次為乙酸、琥珀酸，這三種酸約占總有機酸的70%左右，是冰梨酒中的三種主要有機酸。菌株DV10產生的乙酸含量最高，達到了1.44 g/L，比菌株R2高7.46%；菌株KD10所釀制的冰梨酒中蘋果酸含量最高。乙酸含量低、蘋果酸含量高有利于冰梨酒感官品質，因此，從產有機酸的角度考慮，釀制冰梨酒的適宜菌株為KD10、K1和71B。乙酸主要是由酵母代謝產生的，酒石酸、蘋果酸、檸檬酸則來自于梨果實。酵母既能代謝消耗有機酸，自身也能產生有機酸[16]。因此，造成不同酵母菌株發酵的冰梨酒中有機酸含量有較大差異。

2.2.3 冰梨酒的感官評價

對8株酵母菌發酵的冰梨酒進行感官評價，結果見表7。由表7可知，8株菌所釀制的冰梨酒澄清度沒有差異。在色澤上，由于菌株DV10和EC1118比其他菌株所發酵的冰梨酒色澤更深，呈深褐黃色，因而二者的感官評價得分稍低。8株菌所釀制的冰梨酒感官品質存在一定差異，主要表現在香氣和口味上，其中菌株R2的得分最高。在風格上，菌株R2和R-HST得分最高。從感官評價的總分看，菌株R2的感官評分最高。

表78 株酵母所釀的冰梨酒感官評價結果Table 7 Sensory evaluation results of ice pear wines brewed by eight yeast strains

根據上述的試驗結果，從生長能力、降糖及產酒精能力的角度考慮，菌株DV10的性能最優，但該菌株所釀制的冰梨酒色澤差，香氣和口味也不夠好。菌株R2的綜合發酵性能僅次于DV10而明顯好于其他6株菌，且其感官質量最優。綜合考慮，確定釀酒酵母R2為釀制冰梨酒的適宜菌種。

3 結論

本研究以鴨梨為原料，接種釀酒酵母進行低溫酒精發酵釀制冰梨酒。通過分析比較8株釀酒酵母的冰梨酒發酵性能，以及所釀制冰梨酒的理化指標、有機酸含量和感官品質，最終確定釀酒酵母R2為釀制冰梨酒的適宜菌種。該酵母生長繁殖快，降糖和產酒精能力強，發酵性能優良；釀出的冰梨酒酒香和諧，果香純正，口感甜美醇厚、柔和爽口，具有冰梨酒特有的風味。與未發酵的冰梨汁相比，冰梨酒的總酸及揮發酸大幅度增加，且均符合GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中規定的質量標準。為冰梨酒的研究與開發提供一定的參考。

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Screening ofSaccharomyces cerevisiaefor ice pear wine brewing

ZHAO Guoqun1,ZHANG Xiaoteng1,ZHAO Yifan1,GUAN Junfeng2*
(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China; 2.Institute of Genetics and Physiology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

The"Ya"pear,as the raw material,was squeezed and frozen concentrated into pear juice(ice pear juice),and then the concentrated juice was inoculatedSaccharomyces cerevisiaeand alcohol fermentation happened at low temperature(15℃).Through comparing the fermentation performances of eightS.cerevisiaeand the physicochemical indexes,organic acids contents and sensory quality of ice pear wine brewed by eight yeast strains,theS.cerevisiaeR2 was finally identified as the optimal yeast strain for ice pear wine brewing.The strain R2 had the characteristics of rapid growth,strong sugar-reducing and alcohol-producing capacity and excellent fermentation performances.The ice pear wine had sweet and full-bodied tastes with mellow and elegant fruit aroma,and showed typical flavor of ice pear wine.

ice pear wine;Saccharomyces cerevisiae;alcohol fermentation;screening

TS255.47

0254-5071（2017）06-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.016

2017-02-20

國家現代農業[梨]產業技術體系建設專項（cars-29）

趙國群（1963-），男，教授，博士，研究方向工業微生物技術。

*通訊作者：關軍鋒（1966-），男，研究員，博士，研究方向果品貯藏加工。