赤水曬醋一株產氣微生物的分離鑒定

白成松，盧紅梅，楊新，任勰珂，安家靜，陳莉*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025）

赤水曬醋一株產氣微生物的分離鑒定

白成松1，盧紅梅2，楊新2，任勰珂2，安家靜2，陳莉1*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025）

為了解赤水曬醋產氣原因，采用多種培養基分離和計數產氣微生物，并檢測其生理生化特征，生長特性以及16S rDNA基因序列分析。實驗結果表明，從變質曬醋中分離到一株產氣微生物，編號為N9，革蘭氏陽性，有芽孢，最適生長溫度為45℃，最適生長pH值為5.5，最適生長鹽度（氯化鈉含量）為1%，繁殖能力強。經過16S rDNA基因序列以及系統發育樹分析可以鑒定該菌為產堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。

赤水曬醋；產氣微生物；分離鑒定；特性研究

食醋是一種酸味調味劑，深受人們的喜愛，根據研究表明食醋具有抗菌殺菌、增強免疫力、預防骨質疏松等功能[1-2]。食醋按生產方法的不同有釀造食醋和人工合成食醋。赤水曬醋作為傳統釀造食醋中的一種，獨具特色。赤水曬醋采用固態發酵繁殖產生天然醋酸菌，醋坯和成品醋均經日光暴曬，因此而得名“曬醋”。原料以麩皮為主，百余種名貴中草藥配方制作醋曲；優質大米、糯米的精選、蒸煮；麥麩、小麥及醋曲與大米粥拌醅；醋醅室內發酵；醋醅裝壇；日光曝曬；醋醅浸淋；產品精釀；滅菌等三十六道工序。整個生產周期要經過兩、三年以上才能成形。曬醋具有香、酸、醇、濃等特點，色呈紅棕色，味酸柔和，稍有甜口，不澀口，不霉變，香氣濃郁。雖然赤水曬醋的酸度達到6°T，不需要添加其他防腐劑，但由于赤水曬醋是傳統釀造食醋，受天時地利、人工操作的影響很大，僅依賴高酸度，其安全性并非絕對能得到保障[3]。

2015年上半年，某曬醋公司的食醋出現嚴重的產氣現象明顯，導致食醋脹袋、脹瓶，甚至爆瓶，這不僅影響了曬醋在消費者中的形象，還給公司帶來了嚴重的經濟損失。近年來，國內已有關于釀造食醋出現產氣現象的相關的研究，張懷敏等[4]研究了導致山西老陳醋脹袋的原因，其研究結果顯示，導致老陳醋產氣的主要原因是產氣芽孢桿菌。鄭宇等[5]比較分析了正常食醋和脹氣食醋樣品的理化指標和活菌數的差異，并分析了脹氣食醋樣品中主要的氣體成分，分離鑒定了食醋中潛在的污染微生物。本研究從赤水產氣曬醋中分離一株產氣的微生物，進行分子生物學鑒定，并研究其生長特性，為防治赤水曬醋產氣提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤水食醋樣品：某曬醋公司提供產氣食醋（問題食醋）和正常食醋；碘化鉀、碘（均為分析純）：貴州賽蘭博科學儀器有限公司；無水乙醇、體積分數為95%乙醇（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；氯化鈉（分析純）：成都臨江化工廠；剛果紅：天津市科密歐化學試劑有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside，dNTP）、Taq DNA聚合酶、MgCl2：上海生工生物工程公司。

平板計數瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅培養基、改良高氏一號、麥芽浸粉肉湯培養基：北京陸橋技術股份有限公司；乳酸細菌培養基：英國Oxoid公司；LB液體培養基（pH3.5）：按相關文獻進行配制。

1.2 儀器與設備

DMS-653廣西生物數碼顯微鏡：深圳市博宇儀器有限公司；∑IGMA電子掃描顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司；SPX-250B智能型生化培養箱、DHG-9140B（101-2B）智能型電熱恒溫鼓風干燥箱：上?，槴\實驗設備有限公司；YXQ-LS-5DS11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；NDJ-1旋轉粘度計：上海天平儀器廠；SITA-t15動態表面張力儀：桂寧（上海）實驗器材有限公司；752N紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；5531型PCR擴增儀：上海珂淮儀器有限公司；DYY-2C雙穩定時電泳儀：上海六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物的分離、純化

無菌條件下吸取混勻的問題食醋0.2 mL，分別加入裝有不同培養基（平板計數瓊脂/馬鈴薯葡萄糖瓊脂/孟加拉紅/改良高氏一號/麥芽浸粉肉湯/乳酸細菌培養基）的培養皿中，用無菌涂布棒在培養基表面輕輕涂布均勻，再用無菌膜封培養皿，然后分別倒置于普通恒溫培養箱和厭氧培養箱中培養3～5d，培養溫度30℃。同時以正常食醋作為對照。食醋中微生物菌落總數、大腸菌群的測定分別參照國標GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》和GB 4789.38—2012《食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數》中的方法執行[6-7]。

將分離到的微生物用相應的固體培養基進行劃線分離純化，傳代3次。并用相應的斜面培養基在4℃條件下保存備用。保存的菌株每個月轉接1次。

1.3.2 產氣和黏度檢測實驗

配制LB培養基，調節pH至3.5，分裝到試管中，并加入杜氏小管，然后進行121℃、20min濕熱滅菌。選擇正常的赤水曬醋，分裝到試管中，并加入杜氏小管，然后進行121℃、20 min濕熱滅菌。

將分離出的微生物接種到上述培養基和正常的赤水曬醋中，30℃培養3～5 d，觀察小導管中是否有氣泡以及檢測培養基的黏度變化[8-9]。同時，以不接種作為對照。

1.3.3 微生物形態觀察以及生理生化測定

將分離出來的主要微生物進行菌落形態觀察（形態、顏色、邊緣、透明度等特征）以及個體形態觀察（染色顯微鏡觀察）。按文獻《伯杰細菌鑒定手冊》[10]和《常見細菌鑒定手冊》[11]分別對獲得的微生物進行生理生化實驗。

1.3.4 16S rDNA基因序列分析

微生物總DNA的提取：利用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取實驗菌株的DNA，其具體步驟參見試劑盒的說明書。DNA提取產物保存于-20℃冰箱中。

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16S rDNA：以提取的基因組DNA為模板，利用通用引物正向引物27F和反向引物1492R進行PCR擴增。通用引物ITS1和ITS4被用于rDNA ITS區段的PCR擴增。它們的序列是：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應在標準反應體系中完成。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；95℃變性50 s，56℃復性50s，72℃延伸90s，30個循環；最后于72℃延伸10min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測。

DNA測序：純化后的目的基因送上海生工公司進行測序。測序結果用Chromas軟件參照正反序列圖譜進行人工校正。

系統發育樹的構建：用BLAST將測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中與已知細菌的16S rDNA基因序列進行同源性分析，并用MEGA5.10軟件的鄰接法（neighborjoining，N-J）法構建系統發育樹，具體確定菌株的種屬。

1.3.5 微生物生長特性研究[12-15]

活化菌種：將分離的主要的菌株接種在裝液量為100mL/ 250mLLB液體培養基中，在30℃條件下培養24 h。

培養溫度的影響：接入10%活化菌株于裝液量為100mL/ 250mLLB液體培養基中，分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃條件下，靜置培養24 h，搖勻后測定各菌液的OD600nm值，并繪制溫度對菌株生長影響的曲線。

鹽度對微生物生長的影響：分別配制含有0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%NaCl的LB液體培養基，然后進行121℃、20min濕熱滅菌。再接入10%的活化菌種，靜置培養24 h，搖勻后測定各菌液的OD600nm值，并繪制鹽度對菌株生長影響的曲線。

pH對微生物生長的影響：配制LB培養基，分裝于250mL的三角瓶中，并調節pH值至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5，然后進行121℃、20 min濕熱滅菌，以滅菌后實際測得的pH為準。然后接入10%活化菌種，靜置培養24 h，搖勻后測定各菌液的OD600nm值，并繪制pH對菌株生長影響的曲線。

微生物生長曲線繪制：將活化的菌種接種到LB培養基最適生長鹽度、最適生長pH中，置于其最適生長溫度下，靜置培養，培養前的16 h，每隔4 h測量1次OD600nm值，培養16 h后，每隔8 h測1次OD600nm值，連續測5 d。

2 結果與分析

2.1 問題食醋中產氣微生物形態學觀察

采用不同培養基（平板計數瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、孟加拉紅、改良高氏一號、麥芽浸粉肉湯、乳酸細菌培養基）在好氧和厭氧條件下培養變質食醋。研究發現，只有用平板計數瓊脂培養基在厭氧條件下才長出微生物，并且數量不多，其他的培養基無論是在好氧還是厭氧條件下都不能長出微生物。分離出的微生物經過產氣和黏稠增加實驗，得到主要的1株微生物，編號為N9，其在LB液體培養基中產氣明顯，在正常的赤水曬醋中產氣緩慢，菌株N9菌落形態及電鏡圖見圖1。

由圖1（A）可知，菌株N9菌落呈黃色，表面濕潤光滑，邊緣整齊，易挑起，透明；菌株N11菌落呈淺黃色，表面濕潤光滑，邊緣不整齊，易挑起，不透明。由圖1（B）可知，該株菌為桿狀，長約1.423 6 μm，直徑約0.694 4 μm。

2.2 菌株N9生理生化測定結果

按文獻《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌鑒定手冊》對菌株N9進行生理生化測定，測定結果見表1。

2.3 菌株N9分子生物學鑒定

采用16S rDNA測序方法對菌株N9進行分子生物學鑒定，對DNA進行序列擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將所得測序結果輸入NCBI進行BLAST對比，采用N-J法構建系統發育樹，結果見圖2。

圖2 菌株N9基于16S rDNA基因序列建立的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain N9 based on 16S rDNA sequence

由圖2可知，菌株N9的16S rDNA基因序列比對結果與為產堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）相似度為98%，與Providencia alcalifaciens最為接近。結合菌株N9的細胞形態、菌落形態、生理生化特征，可以鑒定菌株N9為產堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。

2.4 菌株N9生長特性的研究

2.4.1 培養溫度對菌株N9生長的影響

圖3 培養溫度對菌株N9生長的影響Fig.3 Effects of culture temperature on the growth of strain N9

由圖3可知，菌株N9在培養溫度30～40℃范圍內，OD600nm值上升比較緩慢；在培養溫度40～45℃范圍內，OD600nm值上升較快；在培養溫度45℃時，OD600nm值達到最大值；培養溫度＞45℃之后，OD600nm值先快速下降，再緩慢下降，最后OD600nm值接近為0。因此，菌株N9的最適生長溫度為45℃。2.4.2 pH對菌株N9生長的影響

由圖4可知，菌株N9在pH 2.5～5.5，OD600nm值逐漸增加；菌株N9在pH值為5.5時，OD600nm值達到最大值；菌株N9在pH＞5.5之后，OD600nm值快速的下降。因此，菌株N9最適生長pH值為5.5。

圖4pH對菌株N9生長的影響Fig.4 Effects of pH on the growth of strain N9

2.4.3 鹽度對菌株N9生長的影響

圖5 鹽度對菌株N9生長的影響Fig.5 Effects of salinity on the growth of strain N9

由圖5可知，菌株N9在鹽度為0～1%時，OD600nm值逐漸增加；菌株N9在鹽度為1%時，OD600nm值達到最大值；菌株N9在鹽度＞1%之后，OD600nm值逐漸下降。因此，菌株N9的最適生長鹽度為1%。

2.4.4 菌株N9生長曲線

圖6 菌株N9的生長曲線Fig.6 Growth curves of strain N9

由圖6可知，在0～16 h之間，菌株N9處于對數生長期，菌體快速繁殖，OD600nm值變化最大，隨后由于營養物質的大量消耗，在16～24 h之間，菌株N9生長開始變緩，24～64 h之間菌株N9進入穩定期，細菌數目和代謝產物達到最高水平，菌體OD600nm值較穩定，64 h后菌株N9進入衰亡期，菌體開始死亡，OD600nm值開始下降，從OD600nm值變化趨勢來看，菌株N9具有較快的生長速度，對數期開始比較早。

3 結論

通過用不同培養基在好氧和厭氧條件下培養變質食醋，結果發現，只有用平板計數瓊脂在厭氧條件下才長出微生物，并且數量不多，其他的培養基無論是在好氧還是厭氧條件下微生物都不生長。分離出的微生物經過產氣驗證實驗，得到主要的一株產氣微生物。通過檢測其生理生化特征，以及16S rDNA基因序列分析，鑒定出該菌為產堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens）。通過對該株菌做生長特性實驗得知，該株菌的最適生長溫度為45℃，最適生長pH為5.5，最適生長鹽度為1%，具有較快的生長速度，對數期開始比較早。充分了解菌株N9的生長特性，為防治曬醋產氣提供一定的理論基礎。

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Isolation and identification of a gas-producing bacterium from Chishui sun vinegar

BAI Chengsong1,LU Hongmei2,YANG Xin2,REN Xieke2,AN Jiajing2,CHEN Li1*
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guiyang 550025,China)

In order to figure out the aerogenesis reason of Chishui sun vinegar,using a variety of culture mediums to isolate and count gas-producing microorganism,and the physiological-biochemical characteristics of strains were detected and 16S rDNA gene sequence were analyzed.The results showed that one gram-positive bacterium with spore,coded as N9,was isolated from the samples of Chishui sun vinegar.The optimum growth temperature of the strain was 45℃,pH was 5.5 and the optimum growth salinity(NaCl content)was 1%.The strain had strong reproduction ability. Through the analysis of 16S rDNA gene sequences and phylogenetic tree analysis,the strain N9 was identified asProvidencia alcalifaciens.

Chishui sun vinegar;gas-producing microorganisms;isolation and identification;characteristic research

TS264.2

0254-5071（2017）06-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.015

2017-04-07

貴州大學研究生創新基金（2016055）

白成松（1991-），男，碩士研究生，研究方向發酵工程。

*通訊作者：陳莉（1981-），女，副教授，碩士，研究方向應用微生物。