10種非釀酒酵母硫化氫產生能力及動態分析

王優蓓，肖鳳，季雪傲，陳福生，張秀艷*

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070；2.華中農業大學環境食品學教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

10種非釀酒酵母硫化氫產生能力及動態分析

王優蓓1，2，肖鳳1，2，季雪傲1，2，陳福生1，2，張秀艷1*

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070；2.華中農業大學環境食品學教育部重點實驗室，湖北武漢430070）

為了分析10種非釀酒酵母產H2S動態以及與發酵速度的相關性，該研究利用亞硫酸鉍瓊脂平板法和醋酸鉛試紙法分別分析了10種酵母在固態和液態條件下產H2S的情況，并對其H2S產生動態以及與發酵速度的相關性進行分析。結果表明，在亞硫酸鉍瓊脂固態平板上，7種非釀酒酵母產生H2S，而在YPD液體培養基中，10種非釀酒酵母均產生H2S，產H2S的能力差異明顯，熱帶假絲酵母產H2S最多，且產氣速度與發酵速度呈正相關。該研究結果將為非釀酒酵母的應用提供了參考依據，并為其他非釀酒酵母以及其他發酵微生物的篩選提供借鑒意義。

非釀酒酵母；硫化氫；醋酸鉛試紙法；亞硫酸鉍瓊脂平板法

果酒因具有較高的營養和保健功能，契合了當代人們對綠色和健康理念的追求，深受消費者青睞[1]。隨著“由高度酒向低度酒，由糧食酒向果酒發展”的酒業政策調整，果酒市場蓬勃發展，果酒風味差成為困擾果酒發展的限制性因素。造成這一問題的主要原因是利用純種釀酒酵母進行發酵（即純種發酵）。純種發酵操作簡單、易控制、果酒品質統一，但釀酒酵母產生風味物質少，導致果酒風味差[2]。

近年來，利用非釀酒酵母與釀酒酵母的混合發酵改善果酒風味成為了研究的熱點[3-6]，多款果酒的風味得到改善[7-9]。項目組也已從自然發酵柑橘酒中分離了10種非釀酒酵母，并對其發酵特性和耐受性進行分析，顯示了10種非釀酒酵母具有改善果酒風味能力，且耐受性和發酵性能較好[10-12]。然而，非釀酒酵母可能會產生不良風味物質，如含硫化合物、醋酸和高級醇[13]。H2S是揮發性最強的含硫化合物，有臭雞蛋味，人對H2S的嗅覺閾值很低，每升含數十至數百微克時對感官刺激明顯[14]，因此H2S產生可能會造成果酒不良風味。不同種酵母產H2S能力差異較大[15]，因此有必要開展非釀酒酵母產H2S能力的分析。

鑒于此，本研究對10種非釀酒酵母產生H2S情況及其動態變化進行分析，在用亞硫酸鉍瓊脂法分析固態平板上非釀酒酵母產H2S情況基礎上，用醋酸鉛試紙法分析非釀酒酵母液體發酵時產H2S情況，并對其產生動態及其與發酵速度的相關性進行分析，研究結果將為10種非釀酒酵母在果酒中的應用提供指導，并為其他非釀酒酵母，甚至其他發酵微生物的篩選提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

加利福尼亞擬威爾酵母（Barnettozyma californica），矮小假絲酵母（Candida humilis），熱帶假絲酵母（Candida tropicalis），葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae），葡萄汁薊馬酵母（Hanseniaspora occidentalis），仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae），葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），陸生畢赤酵母（Pichia terricola），德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）：華中農業大學環境食品學教育部重點實驗室。

分析所用試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，過濾后121℃濕熱滅菌20min；亞硫酸鉍瓊脂培養基（bismuthsulfite agar，BS）：青島高科園海博生物技術有限公司，加熱煮沸至完全溶解，無需高壓滅菌，保存于黑暗處，48 h內使用。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IF型超凈工作臺：蘇中凈化設備有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；HZ250LB型搖床：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AR5120型電子天平：美國奧豪斯公司；GI80TR型高壓蒸汽滅菌鍋：美國致微儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞硫酸鉍瓊脂平板法分析10種非釀酒酵母產H2S情況

用接種環刮取2環酵母至裝有6 mL YEPD培養基的試管中，28℃，120 r/min培養12 h。取2 mL活化菌液至2 mL離心管中，4℃、5 000 r/min離心5 min，收集菌體，加入2 mL無菌生理鹽水洗滌，共洗滌3次。用血球計數板計數后，加入900 μL無菌生理鹽水系列稀釋酵母濃度至106個/mL。用鑷子夾取滅菌的濾紙片貼在事先準備好的亞硫酸鉍培養基表面，吸取10μL濃度為106個/mL的菌液并慢慢滴加在濾紙片上，待液體完全吸入培養基后，28℃倒置培養5 d，觀察培養基的變色情況，產H2S能力由高到低的顯色情況分別為顯棕黑色、棕色、墨綠色、淡墨綠色及不顯色。

1.3.2 檢測用醋酸鉛試紙的制備

將濾紙裁成1.5 cm×10 cm的紙條，卷成紙卷插入塑料管（直徑為8 mm）中并121℃濕熱滅菌20 min。均勻滴加200 μL過濾除菌（0.45 μm硝酸纖維素膜）的0.3%醋酸鉛溶液于濾紙片上，室溫下自然晾干后備用。

1.3.3 醋酸鉛試紙法分析10種非釀酒酵母產H2S情況

參照韓娜等[16]的方法。在裝有80mLYEPD培養基的三角瓶（100 mL）中接入100 μL種子液，將標好刻度的醋酸鉛試紙條插入式管并將試管插入三角瓶，28℃、120 r/min培養5 d，讀取試紙變色長度。H2S的生成量越多，試紙變色長度越長。試紙變色原理是酵母生成的H2S與濾紙條上的醋酸鉛反應，生成黑色的硫化鉛，由于浸泡濾紙條的試劑總量已知，所以可以測量試紙變色的長度來換算不同酵母H2S的生成量，試紙條每顯色1 mm表示H2S的生成量為7.86 μg/L。

1.3.4 10種非釀酒酵母產H2S動態分析

活化、接種、培養方法同1.3.3，每12 h讀取試紙變色長度，以時間（h）為橫坐標，H2S累計生成量（μg/L）為縱坐標，做出10種非釀酒酵母產H2S的動態曲線。

1.3.5 10種非釀酒酵母產H2S和發酵速度關系分析

活化、接種、培養方法同1.3.3，每12 h讀取試紙變色長度，稱量法計算發酵液失去的質量（即CO2釋放量），以時間（h）為橫坐標，H2S累計生成量（μg/L）和CO2累計釋放量（mg/L）為縱坐標，作10種非釀酒酵母產H2S和發酵速度關系圖。

2 結果與分析

2.1 亞硫酸鉍瓊脂平板法分析10種非釀酒酵母產H2S情況

通過方法1.3.1分析了10種非釀酒酵母在亞硫酸鉍瓊脂平板上產H2S能力，結果見圖1。由圖1可知，H.uvarum、C.lusitaniae、T.delbrueckii幾乎不產H2S，C.tropicalis、P.terricola、B.californica、H.occidentalis、H.opuntiae、P.kudriavzevii、C.humillis均產H2S。產H2S能力最強的為P.kudriavzevii，其次為B.californica、H.opuntiae，而P.terricola、C.humillis產H2S能力較弱，C.tropicalis、H.occidentalis產H2S能力很弱。

圖1 亞硫酸鉍瓊脂平板法分析10種非釀酒酵母產H2S情況(28℃,5 d)Fig.1 H2S production conditions of ten non-Saccharomyceson the bismuth sulfite agar medium(28℃,5 d)

2.2 醋酸鉛試紙法分析10種非釀酒酵母產H2S情況

由10種非釀酒酵母在亞硫酸鉍培養基上生長的結果可以初步判定各菌株產H2S情況，但工業生產多數為液態發酵，酵母在液態培養基中產H2S情況可能會有所不同，因此利用醋酸鉛試紙法測定酵母在YEPD培養基中H2S的生成量，進一步探究10種非釀酒酵母的產H2S情況。通過方法1.3.3進一步探究10種非釀酒酵母在液態培養基中生長時產H2S情況，結果如圖2所示。

圖210 種非釀酒酵母在YEPD培養基條件下產H2S情況(28℃,5 d)Fig.2 H2S production conditions from ten non-Saccharomyceson YEPD medium(28℃,5 d)

由圖2可知，10種非釀酒酵母均產H2S，其中P.kudriavzevii產H2S量最高，H.opuntiae最低。10種非釀酒酵母產H2S為P.kudriavzevii（189.82 μg/L）＞C.tropicalis（130.15 μg/L）＞C.humillis（84.63 μg/L）＞P.terricola（70.80 μg/L）＞B.californica（38.44 μg/L）＞H.occidentalis（25.29 μg/L）＞C.lusitaniae（17.53 μg/L）＞H.uvarum（15.51 μg/L）＞T.delbrueckii（13.49 μg/L）＞H.opuntiae（10.11 μg/L）。

醋酸鉛試紙法篩選出的低產H2S酵母為C.lusitaniae、H.uvarum、T.delbrueckii和H.opuntiae，亞硫酸鉍平板法篩選出的低產H2S酵母為C.tropicalis、H.occidentalis、H.uvarum、C.lusitaniae和T.Delbrueckii。H2S大部分是來自發酵時酵母對含硫氨基酸、硫酸鹽和亞硫酸鹽的同化作用，以及酵母合成蛋氨酸受抑制時的中間產物。兩種方法篩選出的低產H2S酵母存在差異，主要原因有兩點：一是發酵速度對H2S的生成起決定性的作用，液體培養基和固體培養基的發酵速度必然是液體中更快。二是兩種培養基的成分不同產生H2S的代謝途徑不同[17]。亞硫酸鉍瓊脂平板使用于評估固態發酵，含有外源硫元素的發酵條件下H2S產量。醋酸鉛試紙法適用于評估液態發酵，有含硫蛋白的發酵條件下H2S的產量。

2.3 10種非釀酒酵母產H2S的動態分析

通過方法1.3.4醋酸鉛試紙法分析10種非釀酒酵母產H2S動態，結果如圖3所示。由圖3可知，P.kudriavzevii、C.tropicalis、C.humillis和P.terricola這些高產H2S的菌株在0～12 h間H2S產量一直呈上升趨勢，12h產量達最大，H2S產生量分別為178.70μg/L、81.93μg/L、73.50μg/L、65.74μg/L；C.lusitaniae、T.delbrueckii和H.opuntiae這些低產H2S的菌株在培養12 h后開始產H2S，C.lusitaniae、T.delbrueckii在24 h時產H2S量最大，H.opuntiae在60 h達產H2S量最大，H2S產生量分別為，10.45 μg/L、8.09 μg/L、6.74 μg/L。同時，C.tropicalis、P.terricola、B.californica、C.lusitaniae和T.delbrueckii的H2S動態曲線存在“雙峰”現象，且發酵前期的峰值高于發酵后期的峰值，這一現象與王春曉等[18]報道一致，但本研究中第一個峰值出現的時間（12～24 h）比其報道的（88 h）要早，第二個峰值為72 h。酵母產H2S的“雙峰”現象可能是由于發酵前期，H2S大多由蛋氨酸產生，隨著蛋氨酸含量降低，對硫酸鹽代謝的抑制減弱，發酵中后期H2S主要由半胱氨酸或硫酸鹽代謝生成[20]。H.occidentalis、H.opuntiae、P.kudriavzevii和C.humillis的H2S動態曲線僅出現單峰，無雙峰的出現可能與酵母利用發酵液中氨基酸的情況不同有關。

圖310 種非釀酒酵母產H2S的動態分析Fig.3 Dynamic analysis of H2S production conditions from ten non-Saccharomyces

2.4 10種非釀酒酵母產H2S和發酵速率的關系分析

為探究不同酵母產H2S產生速度和發酵速率的關系，本研究通過方法1.3.5分析了10種非釀酒酵母H2S產量和CO2釋放量之間的關系，結果如圖4所示。

由圖4可知，同種非釀酒酵母，其發酵速度和H2S生成速度基本呈正相關。C.tropicalis在0～12 h時的發酵速度最大，H2S生成速度最高；12～36 h發酵速度減慢，H2S生成速度減緩；36 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度變化很小。P.terricola在0～12 h時的發酵速度最大，H2S生成速度最高；12 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度變化很小。B.californica在0～12 h時的發酵速度較慢，基本無H2S生成；12～36 h發酵速度最大，H2S生成速度最高；36 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度在60～72h時出現變化，但變化較小。H.uvarum在0～120 h發酵速度都很平穩，H2S生成速度雖出現變化，但始終較低。H.occidentalis在0～24h時的發酵速度最大，H2S生成速度在12～24 h最高，稍有延遲；24 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度變化很小。H.opuntiae在0～24 h時的發酵速度最大，但此段時間內無H2S生成，24 h后發酵速度趨于平緩，酵母生成H2S延遲至48 h生成，72 h后；24 h后H2S生成速度基本不變。P.kudriavzevii在0～24 h時的發酵速度最大，H2S生成速度最高；24 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度基本不變。C.humillis在0～24 h時的發酵速度最大，H2S生成速度最高；24 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度基本不變。C.lusitaniae在0～24 h時的發酵速度最大，H2S生成速度在12～24 h最高，稍有延遲；24 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度在60～72 h時出現變化，但變化較小。T.delbrueckii在0～24 h時的發酵速度最大，H2S生成速度在12～24 h最高，稍有延遲；24 h后發酵速度趨于平緩，H2S生成速度在60～72 h時出現變化，但變化較小。發酵前期的H2S主要由蛋氨酸分解產生[19]，在12 h及以后才開始生成H2S的非釀酒酵母可能是由于分解蛋氨酸的相關酶活性低，產生H2S較少。C.lusitaniae的H2S產量（17.53 μg/L）與T.delbrueckii（13.49 μg/L）和H.uvarum的H2S產量（15.51 μg/L）相近，但發酵速度為C.lusitaniae與T.delbrueckii接近，且遠大于H.uvarum，CO2的總釋放量為T.delbrueckii（14.57 mg/L）＞C.lusitaniae（14.48 mg/L）＞H.uvarum（8.20mg/L），發酵速率與H2S產生基本呈正相關。

圖410 種非釀酒酵母發酵速度和H2S產生的關系分析Fig.4 Relationship between fermentation rate and H2S producing speed of ten non-Saccharomyces

3 結論

亞硫酸鉍平板法篩選出的低產H2S酵母為C.tropicalis、H.occidentalis、H.uvarum、C.lusitaniae、T.delbrueckii；醋酸鉛試紙法篩選出的低產H2S酵母為C.lusitaniae、H.uvarum、T.delbrueckii和H.opuntiae；在對酵母產H2S能力進行評價時，培養72 h基本可確定酵母的H2S產量，并且對于同一種酵母，發酵速度越快，產H2S越多，因此較慢的發酵速度有利于減少H2S的生成，避免H2S對果酒帶來的不良影響。為了控制H2S的生成量，盡量減少或控制發酵液中與H2S產生相關的含硫氨基酸、硫酸鹽和亞硫酸鹽的量，如果不同批次原料中含硫氨基酸量一致，就可以有效地控制H2S的生成量。H2S產生情況、動態以及與發酵速度的關系分析結果，將為該酵母在實際生產中的應用提供參考價值，但酵母在實際生產條件下的H2S的產生情況，需要進一步進行分析。

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H2S production capacity and dynamics analysis of 10 non-Saccharomyces

WANG Youbei1,2,XIAO Feng1,2,JI Xueao1,2,CHEN Fusheng1,2,ZHANG Xiuyan1*
(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 2.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology,Ministry of Education,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

In order to analyze the relationship between H2S production dynamics and fermentation rate of 10 non-Saccharomyces,comparative analysis of H2S production capacity of 10 non-Saccharomyceswas carried out on the bismuth sulfite agar medium and in the yeast extract peptone dextrose medium,respectively.Furthermore,their H2S production dynamic analysis and the relativity with their fermentation speed were analyzed in YPD liquid medium.The results indicated that seven non-Saccharomycesspecies could produce H2S on the bismuth sulfite agar medium.However,all 10 non-Saccharomycesspecies could produce H2S in YPD liquid medium with different producing capacities.Additionally,their H2S production capacities were positively correlative with fermentation speeds.Those results will provide references for the application of non-Saccharomyces,and for the screening of other non-Saccharomycesstrains or other microorganisms.

non-Saccharomyces;H2S;lead acetate test paper method;bismuth sulfite agar method

TS261.1

0254-5071（2017）06-0023-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.005

2016-10-02

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目（2662015PY068）；寧夏回族自治區重點研發項目重大項目(2016BZ06)；國家自然科學基金資助（31071588）

王優蓓（1994-），女，本科生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：張秀艷（1973-），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。