骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對光氣吸入性肺損傷大鼠肺組織及血漿炎癥因子的干預(yù)作用

閔思慶， 何岱昆， 鐘志越， 陳俊峰， 申 捷

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院重癥監(jiān)護室，上海 201508

·短篇論著·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對光氣吸入性肺損傷大鼠肺組織及血漿炎癥因子的干預(yù)作用

閔思慶， 何岱昆， 鐘志越*， 陳俊峰， 申 捷

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院重癥監(jiān)護室，上海 201508

目的： 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMD-MSCs)移植對光氣吸入性肺損傷大鼠肺組織及血漿炎癥因子的干預(yù)作用。方法： 96只雄性SD大鼠隨機分為：空氣對照組(A組)、BMD-MSCs干預(yù)對照組(AM組)、光氣染毒組(PH組)、光氣染毒后BMD-MSCs 干預(yù)組(PM組)，每組8只。染毒組按8.33 mg/L動態(tài)恒量染毒5 min。PM組染毒后即刻經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs。4組分別于模型完成后6、24、48 h處死大鼠，取肺組織行病理檢查及肺濕/干比、血氣分析，取血漿行Bio-Plex細(xì)胞因子檢測。結(jié)果： PH組較A組TNF-α濃度明顯升高(P<0.05)；PM組較PH組TNF-α濃度降低(P<0.05)。PM組與PH組血漿IL-4濃度6 h、24 h均降低，以PM組下降更明顯(P<0.05)；48 h明顯升高，以PM組升高更明顯(P<0.05)。PH組較A組IL-10濃度高(P<0.05)；PM組較PH組IL-10濃度高(P=0.013)。結(jié)論： 經(jīng)尾靜脈注射BMD-MSCs后可以使大鼠血漿中抗炎因子IL-4和IL-10逐漸升高，促炎因子TNF-α逐漸下降，提示其對光氣致急性肺損傷大鼠肺具有保護作用。

光氣；急性肺損傷；細(xì)胞因子；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

急性肺損傷目前缺乏有效的的治療方法。盡管近年來通過呼吸支持系統(tǒng)治療急性肺損傷取得了一些進步，但是由不同病因引起的急性肺損傷患者的死亡率仍約占40%[1]。因此有必要研究治療急性肺損傷的有效方法。

光氣一種具有強烈毒性的化學(xué)物質(zhì)。光氣中毒會導(dǎo)致急性肺損傷，其易發(fā)展為難治性肺水腫，甚至引起死亡。目前，光氣導(dǎo)致人體中毒的機制尚不明確。目前國內(nèi)外對研究急性肺損傷中TNF-α、IL-4、IL-10等細(xì)胞因子的變化較為關(guān)注[2]，但有關(guān)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMD-MSCs)移植對急性肺損傷中促炎因子與抗炎因子影響的研究較少。因此，本研究通過探索多種細(xì)胞因子在光氣吸入性肺損傷中及用BMD-MSCs干預(yù)后的變化，以期發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子在急性肺損傷中的變化規(guī)律及相互作用，并分析BMD-MSCs移植對急性肺損傷的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 無血清低糖DMEM、胎牛血清購自美國ScienCell公司。固體三光氣購自浙江海寧中聯(lián)化學(xué)有限公司，N，N-二甲基甲酰胺、環(huán)己烷購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。動態(tài)恒量染毒柜購自第二軍醫(yī)大學(xué)，Bio-Plex 200 System高通量蛋白懸浮芯片分析系統(tǒng)及蛋白懸浮芯片試劑盒購自美國Bio-Rad公司。其他用于本研究的生化試劑為進口分裝或國產(chǎn)純化，具體操作參照說明書。

1.2 實驗大鼠分組及處理 SPF級雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量180～220 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。將大鼠隨機分為4組：空氣對照組(A組)、BMD-MSCs干預(yù)對照組(AM組)、光氣染毒組(PH組)、殺毒后BMD-MSCs干預(yù)組(PM組)，每組24只。A組大鼠吸入空氣，經(jīng)尾靜脈注射PBS；AM組吸入空氣，經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs；PH組進行光氣染毒，經(jīng)尾靜脈注射PBS；PM組光氣染毒后，經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs。染毒方法[3]：將大鼠置于動態(tài)恒量染毒柜中，通入濃度為8.33 mg/L的光氣(由固體三光氣完全溶解于環(huán)己烷后，與N，N-二甲基甲酰胺反應(yīng)生成)，染毒5 min。

所有大鼠模型建立后正常進食水。分別于A組吸入空氣，AM組注射BMD-MSCs，PH組染毒、PM組注射BMD-MSCs后6、24、48 h各處死8只大鼠，經(jīng)腹主動脈采血。全血經(jīng)800×g4℃離心5 min，取血漿-20℃保存待檢。取大鼠肺組織初步處理后待檢。

1.3 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)培養(yǎng)及鑒定 采用貼壁法分離培養(yǎng)MSCs，方法簡述如下：將大鼠斷頸處死后，無菌分離股骨和脛骨；用注射器將骨髓從骨髓腔內(nèi)沖出，收集懸液后離心沉淀；用無血清低糖DMEM洗滌沉淀2次后，加入含20%胎牛血清的低糖DMEM，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞的表型用流式細(xì)胞儀鑒定。收集4～5代細(xì)胞用于急性肺損傷的治療。

1.4 BMD-MSCs移植 在分離培養(yǎng)5代的BMD-MSCs細(xì)胞中加入攜帶GFP的腺病毒，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(轉(zhuǎn)染率約60%)。大鼠經(jīng)光氣暴露染毒成功后，立即經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染率=暗視野所見發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/明視野所見細(xì)胞數(shù)。每個標(biāo)本任取3個高倍鏡視野。

1.5 肺濕/干比分析及病理檢查 將新鮮分離的肺組織經(jīng)PBS洗滌去除殘留血塊后稱質(zhì)量，計作濕質(zhì)量；將肺組織經(jīng)80℃烤箱烘烤至恒重再次稱質(zhì)量，計作干質(zhì)量。兩者的比值即為干濕比。

取右肺上葉置于10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋制成5 μm厚的組織切片，進行蘇木精-伊紅(H-E)染色后，于顯微鏡下觀察，分析大鼠肺組織的病理改變，以判斷肺損傷及肺水腫程度。

1.6 Bio-Plex高通量蛋白懸浮芯片細(xì)胞因子檢測 檢測大鼠血漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、IL-10。所有血漿樣品檢測前4℃水浴解凍，560×g4℃離心10 min，取上清待檢。按說明書準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)樣品、微珠、檢測抗體及Streptavidin-PE熒光色素，以100 μL Bio-Plex Assay緩沖液濕潤濾板，真空吸板機吸凈后，每孔加入微珠混懸液50 μL并吸凈PBS，每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50 μL、抗體25 μL、Streptavidin-PE熒光色素溶液50 μL后室溫?fù)u床10 min。真空吸板機吸凈濾板并用PBS清洗3次，然后用PBS 125 μL重懸微珠，560×g4℃離心10 min室溫?fù)u床30 s后放入儀器中檢測。

2 結(jié) 果

2.1 病理檢查結(jié)果 H-E染色(圖1)顯示：同一時間點PH組大鼠肺組織出血點較其他3組明顯增多，PM組較其他3組明顯減少。A組與AM組肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯滲出；PH組染毒6 h及24 h肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量紅細(xì)胞；PM組較PH組肺泡結(jié)構(gòu)改善。

圖1 不同時間點各組大鼠肺組織H-E染色結(jié)果

2.2 肺濕/干比 PH組與PM組肺濕/干比明顯高于A組與AM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PM組肺濕/干比低于PH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。PH組及PM組染毒后6、24、48 h肺濕/干比呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠不同時間點肺濕/干比 n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

2.3 血氧分壓(PaO2) PH組及PM組PaO2低于A組及AM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PM組PaO2大于PH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)；PH組和PM組染毒后6、24、48 h PaO2逐漸回升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠不同時間點PaO2 p/mmHg； n=8，

1 mmHg=0.133 kPa.*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

2.4 Bio-Plex高通量蛋白懸浮芯片細(xì)胞因子檢測結(jié)果 PH組大鼠血漿TNF-α值較A組和AM組升高，隨時間推移逐漸下降，但仍高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PH組血漿IL-4濃度在染毒后6、24 h降低，48 h時升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PH組血漿IL-10濃度在染毒后6 h時升高，隨時間推移逐漸下降，但仍高于A組(P=0.02)。PM組TNF-α在BMD-MSCs移植后6、24 h與PH組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，48 h時下降(P=0.013)；PM組血漿IL-4濃度BMD-MSCs移植后呈上升趨勢，48 h時高于PH組(P=0.009)；PM組血漿IL-10在BMD-MSCs移植后呈下降趨勢，但在6、24、48 h時檢測值均高于PH組(P<0.05，表3～表5)。

表3 各組大鼠不同時間點血清TNF-α檢測結(jié)果 ρB/(pg·mL-1)； n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

表4 各組大鼠不同時間點血清IL-4檢測結(jié)果 ρB/(pg·mL-1)； n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

表5 各組大鼠與不同時間點血清IL-10檢測結(jié)果 ρB/(pg·mL-1)； n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

3 討 論

細(xì)胞因子在肺損傷的炎癥發(fā)展過程中起到十分重要的作用[4-5]。各種原因引起的肺損傷均有細(xì)胞因子參與。光氣所致的肺損傷機制目前認(rèn)為有酰化作用、酸燒傷理論、氧化應(yīng)激學(xué)說等[6]。其中，炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中存在相互作用，如：白介素(IL)可激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如JAK/STAT、Ras/ERK和PI3K/Akt[7]，MIP-3趨化因子可以通過自分泌作用增強巨噬細(xì)胞活性，促進TNF-α產(chǎn)生[8]。

本研究中，光氣致肺損傷時，促炎因子TNF-α濃度明顯升高，與邵義如等[9]的研究相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，光氣中毒大鼠IL-1β、IL-6、IL-8水平明顯升高。研究[10]發(fā)現(xiàn)，光氣暴露后，小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6、IL-1β、MIP-2升高。這些研究表明，一些促炎因子在光氣吸入性肺損傷時可上調(diào)。研究[5, 10]顯示，在肺損傷早期，肺泡巨噬細(xì)胞受抗原刺激后分泌TNF-α，而TNF-α可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等進入肺泡腔，且TNF-α及IL-1均可激活免疫細(xì)胞釋放其他細(xì)胞因子，活化Na/K-ATP酶，導(dǎo)致肺水腫。本研究進一步證明，在光氣吸入早期(6 h)，肺損傷仍未明顯進展時，促炎因子的血漿濃度均升高。因此認(rèn)為，光氣中毒時機體迅速發(fā)生炎癥反應(yīng)，大量免疫細(xì)胞激活，釋放炎癥因子，促進肺損傷及肺水腫的發(fā)生發(fā)展。

抗炎因子可負(fù)反饋調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，降低炎癥反應(yīng)程度。IL-4是體內(nèi)主要的抗炎因子，可以抑制Th1細(xì)胞分化，抑制中性粒細(xì)胞激活和調(diào)節(jié)趨化因子[11]。本研究中光氣染毒大鼠血漿IL-4呈先下降后上升的變化趨勢，48 h時明顯高于正常水平。結(jié)果說明，光氣中毒早期，抗炎因子的合成及釋放均被抑制，隨著炎癥反應(yīng)持續(xù)，抗炎因子水平才逐步恢復(fù)。促炎因子與抗炎因子的失衡可能是肺損傷及肺水腫的發(fā)病機制之一。

目前認(rèn)為BMD-MSCs的抗炎機制有直接和間接兩種。直接機制：首先，BMD-MSCs能調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞，使其分泌IL-10，然后通過重組人角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(rhKGF)等因子間接起到抑炎效果[12]；其次，改變樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)免疫應(yīng)答，使成熟的DC1減少TNF-α的分泌，而使DC2增加IL-10的分泌，進而導(dǎo)致Th1釋放干擾素γ(INF-γ)減少，Th2、Treg細(xì)胞分泌IL-4、 IL-10增加[13]。間接機制：BMD-MSCs通過分泌白細(xì)胞介素受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL1Ra)，抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及T細(xì)胞分泌IL-1，進而減輕急性肺損傷時的炎癥反應(yīng)[14]。續(xù)玉林等[15]通過BMD-MSCs移植，上調(diào)了IL-10的表達，進而減輕了十八烯酸所致的大鼠肺損傷。本研究中，光氣肺損傷大鼠移植BMD-MSCs后，TNF-α降低，IL-4、IL-10升高，與上述研究相似。但是，目前關(guān)于BMD-MSCs對急性肺損傷的炎癥調(diào)節(jié)機制仍不清楚，還有待進一步的研究。

綜上所述，BMD-MSCs移植對光氣致急性肺損傷大鼠有一定保護作用；BMD-MSCs移植可升高IL-4、IL-10抗炎因子濃度，降低促炎因子TNF-α濃度，說明BMD-MSCs移植可作為治療急性肺損傷的有效手段，值得進一步研究。

[1] SCIUTO A M, HURT H H. Therapeutic treatments of phosgene-induced lung injury[J]. Inhal Toxicol, 2004, 16:565-580.

[2] 廖 畫, 劉 華.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對急性肺損傷大鼠的治療作用[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥, 2014, 21(3): 188-193.

[3] 黃文彬, 申 捷, 張 琳, 等. 烏司他丁對光氣致大鼠急性肺損傷的保護及與基質(zhì)金屬蛋白酶-9的關(guān)系[J]. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2010,28(7):498-504.

[4] CHEN J, SHAO Y, XU G, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells attenuate phosgene-induced acute lung injury in rats[J]. Inhal Toxicol, 2015, 27(5): 254-261.

[5] GOODMAN R B, PUGIN J, LEE J S, et al. Cytokine-mediated inflammation in acute lung injury[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2003,14:523-535.

[6] 何岱昆, 申 捷. 光氣吸入性肺損傷的研究進展[J]. 職業(yè)衛(wèi)生與應(yīng)急救援,2007,25(2):78-81.

[7] HIRANO T, ISHIHARA K, HIBI M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors[J]. Oncogene,2000,19(21):2548-2556.

[8] WARD P A. Role of complement, chemokines, and regulatory cytokines in acute lung injury[J]. Ann N Y Acad Sci,1996,796:104-112.

[9] 邵義如, 申 捷, 李 衛(wèi)，等. 磷酸化絲裂原活化蛋白激酶在大鼠光氣吸入性肺損傷中的作用及其與基質(zhì)金屬蛋白酶9的關(guān)系[J]. 中華燒傷雜志,2013,29(3):261-266.

[10] DADA L A, SZNAJDER J I. Hypoxic inhibition of alveolar fluid reabsorption[J]. Adv Exp Med Biol,2007,618:159-168.

[11] WU C L, LIN L Y, YANG J S, et al. Attenuation of lipopolysaccharide-induced acute lung injury by treatment with IL-10[J]. Respirology,2009,14(4):511-521.

[12] HUH J W, KIM S Y, LEE J H, et al. Bone marrow cells repair cigarette smoke-induced emphysema in rats[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2011,301(3):L255-L266.

[13] AGGARWAL S, PITTENGER M F. Human mesenehymal stemcells modulate allogeneic immune cell responses[J].Blood,2005,105(4):1815-1822.

[14] ORTIZ L A, DUTREIL M, FATTMAN C, et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007, 104(26):11002-11007.

[15] 續(xù)玉林, 李 剛, 呂小東, 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植調(diào)節(jié)TNF-α和IL-10濃度減輕十八稀酸誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷[J]. 心肺血管病雜志,2012,31(3):324-327.

[本文編輯] 姬靜芳

The intervention effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on inflammatory factors in lung tissue and plasma of phosgene inhalation lung injury rats

MIN Si-qing, HE Dai-kun, ZHONG Zhi-yue*, CHEN Jun-feng, SHEN Jie

Intensive Care Unit, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China

Objective： To observe the intervention effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMD-MSCs) on inflammatory factors in lung tissue and plasma of phosgene inhalation lung injury rats. Methods： 96 male SD rats were randomly divided into air control group (group A), BMD-MSCs intervention control group (group AM), phosgene exposure group (group PH) and BMD-MSCs intervention group after phosgene exposure (group PM), with 8 rats in each group. Group PH was exposed to dynamic constant phosgene at 8.33 mg/L for 5 min. Group PM was injected with 106BMD-MSCs via the tail vein immediately after phosgene exposure. The rats in the 4 groups were sacrificed at 6, 24 and 48 h after the models were completed. The lung tissues were taken for pathological examination, lung wet / dry ratio and blood gas analysis. The plasma was taken for the Bio-Plex cytokine test. Results： The level of TNF-α was higher in group PH than group A, and the difference was statistically significant (P=0.02). The level of TNF-α was lower in the group PM than group PH (P<0.05). The plasma IL-4 concentration in group PM and group PH decreased by 6h and 24 h, which was more significant in group PM (P<0.05). It increased significantly by 48h, which was more significant in group PM (P<0.05). The level of IL-10 was higher in group PM than group PH, and the difference was statistically significant (P<0.05). The level of IL-10 was higher in group PM than group PH, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusions： Anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-4 were increased and pro-inflammatory cytokines TNF-α was decreased by the tail vein injection of BMD-MSCs, so BMD-MSCs has a protective effect in rats with acute lung injury induced by phosgene.

phosgene; acute lung injury; cytokines; bone marrow-derived mesenchymal stem cells

2017-02-18 [接受日期] 2017-04-10

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院科學(xué)技術(shù)研究項目(2013-11). Supported by Science and Technology Program of Jinshan Hospital, Fudan University(2013-11).

閔思慶, 住院醫(yī)師. E-mail：49162128@qq.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-34189990-5430, E-mail: zzy1388@aliyun.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170124

R -332

A