合并乙型肝炎病毒感染對彌漫大B細胞淋巴瘤患者血清TNF-α、sIL-2r、IL-6及IL-10水平的影響

魏 征， 施淼頡， 鄒善華， 劉 澎

復旦大學附屬中山醫院血液科，上海 200032

·論 著·

合并乙型肝炎病毒感染對彌漫大B細胞淋巴瘤患者血清TNF-α、sIL-2r、IL-6及IL-10水平的影響

魏 征， 施淼頡， 鄒善華， 劉 澎*

復旦大學附屬中山醫院血液科，上海 200032

目的： 探討合并乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染對彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者血清細胞因子表達水平的影響及其臨床意義。方法： 選擇2013年9月至2014年4月于復旦大學附屬中山醫院血液科住院接受治療的DLBCL患者共77例，測定初治及完全緩解后DLBCL患者血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、可溶性白細胞介素2受體(soluble interleukin-2 receptor，sIL-2r)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及白細胞介素-10(IL-10)的表達水平；以20例年齡匹配的同期健康體檢者作為對照。進一步分析乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽性及陰性DLBCL患者血清中細胞因子水平的差異。結果： 初治DLBCL患者血清TNF-α、sIL-2r及IL-6水平均明顯高于健康對照組(均P<0.05)；緩解期DLBCL患者血清TNF-α和sIL-2r水平明顯低于初治患者(均P<0.05)，但仍明顯高于健康對照組(均P<0.05)。初治DLBCL患者中，HBsAg陽性者的上述血清細胞因子水平與HBsAg陰性者差異無統計學意義；緩解期DLBCL患者中，HBsAg陽性者的血清sIL-2r水平顯著高于HBsAg陰性者(P<0.05)。結論： DLBCL患者血清TNF-α、sIL-2r和IL-6水平升高，其中TNF-α及sIL-2r水平與疾病緩解有關。HBsAg陽性DLBCL患者在疾病緩解后的sIL-2r水平明顯高于HBsAg陰性者，sIL-2r水平與HBsAg陽性DLBCL患者預后不良之間的相關性還有待進一步研究。

彌漫大B細胞淋巴瘤；免疫調節；可溶性白介素-2受體；T淋巴細胞

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)中最常見的亞型，在中國NHL患者中占50%～60%。流行病學數據提示，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染增加了B細胞NHL(B-NHL)的患病風險[1]。在DLBCL患者中，HBV感染率明顯高于T細胞淋巴瘤及濾泡淋巴瘤等其他NHL[2-4]。因此，HBV與DLBCL發病之間存在關聯。本課題組前期研究證實，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽性DLBCL患者接受免疫化療后，緩解率同HBsAg陰性患者相似，但生存期較短[5]，因此提示HBV同時影響DLBCL患者的預后。

既往研究[6-12]證實，細胞因子與B細胞淋巴瘤發病密切相關。在常見細胞因子中，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、可溶性白細胞介素2受體(soluble interleukin-2 receptor，sIL-2r)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及IL-10水平與患者預后相關[13-15]。其中，血清sIL-2r水平可部分替代國際預后指數(international prognostic index，IPI)對患者預后的獨立預測價值[16]，即sIL-2r表達水平越高，患者預后越差[17]。而且化療有效的患者在化療后血清sIL-2r水平可趨于正常化[18]。既往研究[19]還發現，合并HBV感染使DLBCL患者化療后出現更明顯的細胞免疫抑制，主要表現為HBsAg陽性患者的CD4+細胞所占比例明顯降低，較HBsAg陰性者的降低程度更為嚴重，且持續時間更久。那么，合并HBV感染對DLBCL患者細胞免疫抑制的同時，是否對患者血清細胞因子表達產生影響，目前尚無相關報道。因此，本研究旨在分析合并HBV感染對DLBCL患者血清TNF-α、sIL-2r、IL-6及IL-10表達水平的影響，以期進一步探索HBV感染對DLBCL患者預后影響的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年9月至2014年4月在復旦大學附屬中山醫院血液科住院接受化療的DLBCL患者77例。所有患者均由病理確診，根據WHO淋巴造血系統腫瘤分類確診為DLBCL。選取初治DLBCL患者，以及經過一線至少4周期R-CHOP樣方案治療達到完全緩解的DLBCL患者(即緩解期DLBCL患者)，進行病例對照研究；同時與健康成年人進行比較。入組期間共納入初治DLBCL患者36例，其中HBsAg陽性者8例，HBsAg陰性者28例；化療后完全緩解期DLBCL患者41例，其中HBsAg陽性者10例，HBsAg陰性者31例。所有患者均記錄性別、年齡、體力狀態和既往病史等。患者體力狀態以美國東部腫瘤協作組(ECOG)評分表示，并記錄IPI[20]。體檢健康者20例，男女性各10例，標本均來自復旦大學附屬中山醫院體檢中心廢棄生物標本。對照組年齡20～55歲，血常規白細胞密度為(4.58～10.06)×109/L，淋巴細胞比例為25.2%～54.6%，既往無慢性疾病史及腫瘤病史，HBsAg檢測陰性。本研究中生物標本的使用均獲得復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準。所有研究對象均簽署知情同意書。

臨床治療及療效評估本研究納入的DLBCL患者均接受至少4個周期的改良R-CHOP樣方案治療：利妥昔單抗(375 mg/m2，D0)，環磷酰胺(750 mg/m2，D1)，長春地辛(2.8 mg/m2，截頂劑量4 mg，D1)，表柔比星(70 mg/m2，D1)，以及強的松(60 mg/m2，D1-5)聯合化療，每21 d為1個周期。在患者治療前及接受化療后，采用CT、PET-CT或彩色超聲多普勒等影像學手段判斷病灶累及范圍和病灶最大徑，記錄原發病灶位置(淋巴結或結外)，并評估結外病灶數目。本研究納入的緩解期DLBCL患者定義為根據《非霍奇金淋巴瘤療效評價標準》[21]評估獲得完全緩解的患者。

所有患者在治療前后，均接受HBV血清標志物[包括HBsAg、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒e抗體(HBeAb)和乙型肝炎核心抗體(HBcAb)]以及乙型病毒性肝炎脫氧核苷酸(HBV-DNA)檢測；HBsAg陽性者均采用核苷類似物抗病毒藥物(拉米夫定或恩替卡韋)進行抗病毒治療，自化療前或化療當日起，至少服用至化療結束12個月。HBV再激活定義為在治療中HBV-DNA從陰性轉為陽性，或在治療中HBV-DNA滴度較治療前基線值升高1 000倍，本研究人群中未檢測到HBV再激活。

1.2 主要試劑及方法 TNF-α、IL-2受體、IL-6及IL-10水平檢測采用化學發光法，測定試劑盒購自Siemens公司，測定儀器為Siemens IMMULITE

1 000分析儀。

標本收集與處理患者或健康成年人標本均由美國BD公司的SST血清分離膠管收集，均為清晨空腹靜脈血3 mL。凝血后，離心獲得血清100 μL，加入上樣管，上機檢測。后續測定步驟由IMMULITE 1 000分析儀自動完成。

2 結 果

2.1 一般資料比較 分析36例初發DLBCL患者和41例治療后完全緩解期DLBCL患者的年齡、性別、腫瘤分期及IPI危險分組情況，結果顯示差異均無統計學意義(表1)。HBsAg陽性的初發DLBCL者中，3例患者檢測到HBV-DNA(分別為1.11×103、1.06×104和2.07×103)，其余的初發DLBCL患者及全部的緩解期DLBCL患者均未檢測出HBV-DNA。

2.2 不同疾病緩解狀態下DLBCL患者的血清細胞因子水平 初治DLBCL患者中，血清細胞因子TNF-α、sIL-2r和IL-6水平均明顯高于健康對照(均P<0.001)；在治療后達到緩解的DLBCL患者中，血清細胞因子TNF-α和sIL-2r水平均明顯低于初治DLBCL患者(P=0.003，P<0.001)，但仍然高于健康對照(P<0.001，P=0.002，表2)。因此，血清TNF-α、sIL-2r和IL-6水平在DLBCL患者與健康者之間差異明顯，其中TNF-α及sIL-2r水平在DLBCL患者獲得完全緩解前后具有明顯差異。

表1 入組患者一般資料的比較 n

2.3 不同HBV感染狀態下初發DLBCL患者的血清細胞因子水平 在初治DLBCL患者中，將HBsAg陽性者與HBsAg陰性者的血清細胞因子進行比較，發現兩組患者血清TNF-α、sIL-2r、IL-6及IL-10水平差異無統計學意義(表3)，說明初治DLBCL患者的上述細胞因子水平不受合并HBV感染的影響。

血清細胞因子健康對照組(N=20)初治患者(N=36)緩解期患者(N=41)TNF-α水平ρB/(pg·mL-1)6.15±2.1819.38±18.17**9.73±2.67**△△sIL-2r水平zB/(U·mL-1)307.45±90.101849.56±2204.30**412.12±160.21**△△IL-6水平ρB/(pg·mL-1)1.15±0.498.43±9.88**4.66±14.2IL-10水平ρB/(pg·mL-1)2.00±021.28±59.392.54±1.72

**P<0.01與健康對照組相比；△△P<0.01與初治患者相比

血清細胞因子HBsAg陰性患者(N=28)HBsAg陽性患者(N=8)P值TNF-α水平ρB/(pg·mL-1)21.04±20.2013.60±5.200.314sIL-2r水平zB/(U·mL-1)1878.86±2329.061747.00±1831.960.884IL-6水平ρB/(pg·mL-1)8.43±10.418.41±8.370.997IL-10水平ρB/(pg·mL-1)12.11±18.0253.40±121.940.371

2.4 不同HBV感染狀態下緩解期DLBCL患者的血清細胞因子水平 在治療后達到完全緩解的DLBCL患者中，將HBsAg陽性者與HBsAg陰性者的血清細胞因子進行比較。結果發現，HBsAg陽性者血清sIL-2r水平明顯高于HBsAg陰性者(P=0.039)，而血清TNF-α、IL-6及IL-10水平差異無統計學意義(表4)。結果說明，合并HBV感染影響了緩解期DLBCL患者的sIL-2r水平，而不影響其TNF-α、IL-6及IL-10水平。

血清細胞因子HBsAg陰性患者(N=31)HBsAg陽性患者(N=10)P值TNF-α水平ρB/(pg·mL-1)9.74±2.829.70±2.310.963sIL-2r水平zB/(U·mL-1)383.03±135.39502.30±202.540.039IL-6水平ρB/(pg·mL-1)2.52±1.4111.30±28.710.359IL-10水平ρB/(pg·mL-1)2.26±1.003.40±2.950.258

3 討 論

目前已證實，EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、HBV和人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)等病毒與淋巴瘤的發病明顯相關。相關的作用機制主要包括以下幾點：(1)加速淋巴細胞的轉化型生長；(2)激活原癌基因，或使抑癌基因失活；(3)干擾宿主的正常免疫功能[22]。如HIV感染所致獲得性免疫缺陷狀態，使CD4+細胞計數明顯降低，出現各種病毒感染性相關腫瘤，如卡波西肉瘤和淋巴瘤(多為高度侵襲性B-NHL)等。DLBCL為NHL中最常見的亞型，具有高度侵襲性，而且HBV感染相關的淋巴瘤以DLBCL最為多見[2]。HBV感染后亦影響宿主細胞的免疫功能，使CD4+細胞表達下調，CD4+/CD8+比例降低[23]。本課題組前期研究已證實，盡管HBsAg陽性的DLBCL患者在治療后完全緩解率及總緩解率較HBsAg陰性者相似，但HBsAg陽性DLBCL患者的無病生存期(disease-free survival，DFS)和總生存期(overall survival，OS)均較HBsAg陰性者明顯縮短[5,24]。HBsAg陽性DLBCL患者在發病初期的細胞免疫功能與HBsAg陰性患者相似，但在化療中后期CD4+細胞計數及CD4+/CD8+比例低于后者，化療后出現的細胞免疫抑制程度更為嚴重，持續時間也更久[19]。

免疫缺陷、慢性抗原刺激和自身免疫性疾病均與B-NHL的發病風險正相關，而過敏狀態可能降低NHL的發生率[7-8,10,12]。上述這些疾病對B-NHL發病風險的影響均是基于細胞因子的表達水平異常[6,9,11]。常見細胞因子中，血清TNF-α、sIL-2r、IL-6和IL-10水平對DLBCL的預后具有獨立預測價值[13-15]。其中，血清sIL-2r水平可部分替代IPI來預測患者預后[16]。合并HBV感染對DLBCL患者上述細胞因子表達水平的影響及是否由此影響患者預后，在目前均缺少相關的研究報道。因此，本研究通過檢測DLBCL患者治療前后細胞因子TNF-α、sIL-2r、IL-6及IL-10的水平，比較HBsAg陽性DLBCL患者與HBsAg陰性患者在治療前、緩解期的細胞因子表達水平差異，分析HBV感染對DLBCL患者細胞因子表達的影響。

本研究結果顯示，初治DLBCL患者的血清TNF-α、sIL-2r及IL-6水平明顯高于健康對照組，而緩解期DLBCL患者血清TNF-α及sIL-2r水平相較初發患者明顯降低，但仍高于健康對照組，上述差異均有統計學意義。因此，本研究驗證了既往研究的結果，提示DLBCL患者的TNF-α、sIL-2r及IL-6水平與健康者相比存在明顯差異，其中血清TNF-α及sIL-2r水平在初治及緩解期DLBCL患者之間有差異，緩解期DLBCL患者的血清TNF-α及sIL-2r水平趨于正常。

在初治DLBCL患者中，HBsAg陽性及陰性者的上述血清細胞因子水平(TNF-α、sIL-2r、IL-6及IL-10)并無明顯差異；緩解期DLBCL患者中，HBsAg陽性者血清sIL-2r水平明顯高于HBsAg陰性者，而TNF-α、IL-6和IL-10水平無明顯差異。因此，推測合并HBV感染對初治DLBCL患者的上述細胞因子水平無明顯影響，而主要影響緩解期患者的sIL-2r水平。與此類似的是，本課題組此前的研究[19]表明，合并HBV感染對DLBCL患者在治療前的細胞免疫狀態無明顯影響，而在化療后HBsAg陽性患者出現更為明顯而持續的細胞免疫抑制。Lindqvist等[25]研究發現，T調節細胞(T regulatory cells，Treg)通過主動釋放sIL-2r，競爭性結合體內IL-2，從而抑制效應細胞，致使B細胞淋巴瘤患者預后不良。因此，HBsAg陽性DLBCL患者較HBsAg陰性者預后差，其機制可能與合并HBV感染加重了患者化療后的細胞免疫抑制，以及血清sIL-2r水平仍持續相對增高有關。

由于本研究歷時較短，納入病例數相對較少，同時僅選取了化療前后DLBCL患者進行比較，并未對同一患者在治療前后的細胞因子水平進行比較，因此研究結果存在偏倚可能，后續需通過擴大研究樣本及對相同患者的治療前后數據進行比較，來驗證本研究結果。同時，本研究使用了拉米夫定及恩替卡韋等核苷類似物進行抗病毒治療，致使本研究人群未出現HBV再激活，而且緩解期患者未檢測出HBV-DNA，因此難以對HBV復制水平與細胞因子水平之間的關系做進一步分析。另外，合并HBV感染是否通過影響sIL-2r水平，對DLBCL患者的生存造成影響，還需要更完善的生存分析來證實。

[1] OKAN V, YILMAZ M, BAYRAM A, et al. Prevalence of hepatitis B and C viruses in patients with lymphoproliferative disorders[J]. Int J Hematol, 2008, 88(4):403-408.

[2] MARCUCCI F, MELE A. Hepatitis viruses and non-Hodgkin lymphoma: epidemiology, mechanisms of tumorigenesis, and therapeutic opportunities[J]. Blood, 2011, 117(6):1792-1798.

[3] NATH A, AGARWAL R, MALHOTRA P, et al. Prevalence of hepatitis B virus infection in non-Hodgkin lymphoma: a systematic review and meta-analysis[J]. Intern Med J, 2010, 40(9):633-641.

[4] 劉衛平, 鄭 文, 王小沛, 等. 405例非霍奇金淋巴瘤患者乙型肝炎病毒感染率分析[J]. 中華血液學雜志, 2011, 32(8):521-524.

[5] WEI Z, ZOU S, LI F, et al. HBsAg is an independent prognostic factor in diffuse large B cell lymphoma patients in rituximab era: result from a multicenter retrospective analysis in China[J]. Med Oncol, 2014, 31(3):845.

[6] ELENKOV I J, IEZZONI D G, DALY A, et al. Cytokine dysregulation, inflammation and well-being[J]. Neuroimmunomodulation, 2005, 12(5):255-269.

[7] ENGELS E A. Infectious agents as causes of non-Hodgkin lymphoma[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2007, 16(3):401-404.

[8] GRULICH A E, VAJDIC C M, COZEN W. Altered immunity as a risk factor for non-Hodgkin lymphoma[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2007, 16(3):405-408.

[9] MARTINEZ-MAZA O, BREEN E C. B-cell activation and lymphoma in patients with HIV[J]. Curr Opin Oncol, 2002, 14(5):528-532.

[10] MELBYE M, SMEDBY K E, LEHTINEN T, et al. Atopy and risk of non-Hodgkin lymphoma[J]. J Natl Cancer Inst, 2007, 99(2):158-166.

[11] O'SHEA J J, MA A, LIPSKY P. Cytokines and autoimmunity[J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2(1):37-45.

[12] ZINTZARAS E, VOULGARELIS M, MOUTSOPOULOS H M. The risk of lymphoma development in autoimmune diseases: a meta-analysis[J]. Arch Intern Med, 2005, 165(20):2337-2344.

[13] GIACHELIA M, VOSO M T, TISI M C, et al. Interleukin-6 plasma levels are modulated by a polymorphism in the NF-κB1 gene and are associated with outcome following rituximab-combined chemotherapy in diffuse large B-cell non-Hodgkin lymphoma[J]. Leuk Lymphoma, 2012, 53(3):411-416.

[14] GOTO N, TSURUMI H, GOTO H, et al. Serum soluble interleukin-2 receptor (sIL-2R) level is associated with the outcome of patients with diffuse large B cell lymphoma treated with R-CHOP regimens[J]. Ann Hematol, 2012, 91(5):705-714.

[15] USKUDAR TEKE H, GULBAS Z, BAL C. Serum levels of cytokines and prevalence of autoantibodies in lymphoma patients and their prognostic value[J]. J BUON, 2014, 19(1):191-197.

[16] MORITO T, FUJIHARA M, ASAOKU H, et al. Serum soluble interleukin-2 receptor level and immunophenotype are prognostic factors for patients with diffuse large B-cell lymphoma[J]. Cancer Sci, 2009, 100(7):1255-1260.

[17] NIITSU N, IIJIMA K, CHIZUKA A. A high serum-soluble interleukin-2 receptor level is associated with a poor outcome of aggressive non-Hodgkin's lymphoma[J]. Eur J Haematol, 2001, 66(1):24-30.

[18] HARRINGTON D S, PATIL K, LAI P K, et al. Soluble interleukin 2 receptors in patients with malignant lymphoma[J]. Arch Pathol Lab Med, 1988, 112(6):597-601.

[19] 魏 征, 程韻楓, 王志梅, 等. 合并乙肝病毒感染對彌漫大B細胞淋巴瘤患者細胞免疫功能的影響[J]. 中國癌癥雜志, 2014, 24(10):765-769.

[20] International Non-Hodgkin′s Lymphoma Prognostic Factors Project. A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma[J]. N Engl J Med, 1993, 329(14):987-994.

[21] CHESON B D, PFISTNER B, JUWEID M E, et al. Revised response criteria for malignant lymphoma[J]. J Clin Oncol, 2007, 25(5):579-586.

[22] DAVE S S. Host factors for risk and survival in lymphoma[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2010, 2010:255-258.

[23] 李秀梅, 梁樹人, 李順天, 等. 乙型肝炎患者外周血T細胞亞群的分析及意義[J]. 山東醫藥, 2012, 52(20):63-65.

[24] LAW M F, LAI H K, CHAN H N, et al. The impact of hepatitis B virus (HBV) infection on clinical outcomes of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J]. Eur J Cancer Care (Engl), 2015, 24(1): 117-124.

[25] LINDQVIST C A, CHRISTIANSSON L H, SIMONSSON B, et al. T regulatory cells control T-cell proliferation partly by the release of soluble CD25 in patients with B-cell malignancies[J]. Immunology, 2010, 131(3):371-376.

[本文編輯] 葉 婷， 張藝鳴

Effects of hepatitis B virus infection on the serum levels of TNF-α, sIL-2r, IL-6, and IL-10 in patients with diffuse large B cell lymphoma

WEI Zheng, SHI Miao-jie, ZOU Shan-hua, LIU Peng*

Department of Hematology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To investigate the impact of concurrent hepatitis B virus (HBV) infection on serum cytokine levels in patients with diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) and its clinical significance. Methods： Seventy-seven DLBCL patients who were admitted into the Hematology Department of Zhongshan Hospital from September 2013 to April 2014 were selected. The serum levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), soluble interleukin-2 receptor (sIL-2r), interleukin-6 (IL-6), and IL-10 in DLBCL patients were tested before initial chemotherapy and after complete remission. Twenty age-matched healthy subjects who underwent routine physical examination were included as the control. The serum levels of these cytokines in HBsAg positive and negative DLBCL patients were compared, and their clinical significance was further analyzed. Results： Compared with the healthy group, the serum levels of TNF-α, sIL-2r and IL-6 were significantly elevated in DLBCL patients (allP<0.05). The serum levels of TNF-α and sIL-2r in DLBCL patients in the remission group were significantly decreased (bothP<0.05), but were still significantly higher than those in the healthy control group (bothP<0.05). There was no significant difference in serum levels of TNF-α, sIL-2r and IL-6 between HBsAg positive and negative patients before the initial chemotherapy. Of patients in the remission group, HBsAg positive patients had higher serum level of sIL-2r as compared with the HBsAg negative patients (P<0.05). Conclusions： The serum levels of TNF-α, sIL-2r and IL-6 were elevated in patients diagnosed with DLBCL, and the serum levels of TNF-α and sIL-2r were associated with disease remission. Higher serum sIL-2r level in HBsAg positive DLBCL patients after complete remission may help to explain their inferior outcome, which needs further study.

diffuse large B cell lymphoma; immunomodulation; soluble interleukin-2 receptor; T lymphocyte

2017-04-10 [接受日期] 2017-05-07

上海市衛生和計劃生育委員會科研課題(201440390). Supported by Research Project of Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission(201440390).

魏 征，博士，主治醫師. E-mail: wei.zheng@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990-607405, E-mail: liu.peng@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170298

R 551.2

A