一株全基因合成的高溫嗜堿甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

汪斌+張華山+熊海容

摘要：根據(jù)來源于褐色高溫單孢菌（Thermomonospora fusca）YX基因組序列，預(yù)測并合成了甘露聚糖酶ManB全基因序列（Accession No. KJ806638），與表達(dá)載體pPIC9K重組后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115，篩選獲得重組菌株ManB-GS115。其酶學(xué)性質(zhì)檢測結(jié)果表明，該酶最適溫度為70 ℃，最適pH為9.0。該甘露聚糖酶ManB在堿性高溫環(huán)境下有較高的酶活力，可應(yīng)用于食品、釀造、飼料、紡織和醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：甘露聚糖酶；畢赤酵母（Pichia pastoris）；基因合成；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：Q19 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）12-2356-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.039

Analysis Enzymatic Characterization of A Gene Synthesis of Thermostable and Alkaliphiles Endo-β-1，4-mannanase

WANG Bin1， ZHANG Hua-shan2， XIONG Hai-rong1

（1. College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China；

2.Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract：According to the known genomic sequences of Thermomonospora fusca YX and the codon bias of yeast，the optimized mannanase ManB sequence（Accession No. KJ806638） was designed and synthesized. The ManB gene was cloned into the pPIC9K vector，and then expressed in Pichia pastoris GS115 to obtain ManB. The enzymatic properties were shown that the optimal reaction temperature was 70 ℃ and pH was 9.0. With the excellent enzymatic properties，the mannanase ManB could be potentially applied in brewing， food， feed， textileand pharmaceuticals fields.

Key words：mannanase； Pichia pastoris； gene synthesis； enzymatic properties

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一種能水解含有β-1，4-D-吡喃甘露糖苷鍵的甘露寡糖和甘露多糖（包含甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等）的內(nèi)切水解酶。甘露聚糖是植物半纖維素中僅次于木聚糖的第二大組分，廣泛分布于植物組織中。β-甘露聚糖酶能將甘露聚糖等多聚糖降解為葡萄糖、甘露寡糖等[1，2]。

隨著對(duì)β-甘露聚糖酶的深入研究，其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷地?cái)U(kuò)展，并擁有一個(gè)廣泛的工業(yè)酶應(yīng)用市場，包括食品和飼料、咖啡萃取、生物乙醇生產(chǎn)、殺黏菌劑、制藥、紡織、洗滌、造紙、石油、天然氣工業(yè)及生物技術(shù)等領(lǐng)域[3，4]。來源于細(xì)菌的甘露聚糖酶普遍比來源于真菌的甘露聚糖酶具有更高的穩(wěn)定性，將來源于細(xì)菌的甘露聚糖酶基因經(jīng)序列優(yōu)化后應(yīng)用于可高密度培養(yǎng)的畢赤酵母（Pichia pastoris），更適于工業(yè)化生產(chǎn)。來源于褐色高溫單孢菌（Thermomonospora fusca）的甘露聚糖酶1BQC具有較優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)[5]，屬于糖苷水解酶類第5家族，其基因大小為906 bp，氨基酸序列大小為302 aa，預(yù)測其分子質(zhì)量為33.1 ku，隨著其結(jié)晶體三維結(jié)構(gòu)等研究深入，利于進(jìn)行體外突變等研究。將該酶基因序列優(yōu)化后，能在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，可在飼料添加劑、保健食品、造紙、洗滌、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）Top 10菌株由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保藏，畢赤酵母GS115和表達(dá)載體pPIC9K為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等工具酶及DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒DNA小量試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒等購自上海AxyPrep公司；底物L(fēng)ocust bean gum from Ceratonia siliqua seeds購于Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract購于Oxoid公司；無氨基酵母氮源（YNB）、D-sorbitol、Agar、氨芐青霉素（Ampicillin Sodium Salt）購于Biosharp公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 畢赤酵母組氨酸缺陷型選擇培養(yǎng)MD，畢赤酵母生長/誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY/BMMY，大腸桿菌生長培養(yǎng)基LB，畢赤酵母生長培養(yǎng)基YPD等培養(yǎng)基配方見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.2 方法

1.2.1 甘露聚糖酶ManB基因序列的獲得 根據(jù)序列比對(duì)，來源于褐色高溫單孢菌甘露聚糖酶1BQC（PDB：1BQC_A）的氨基酸序列與預(yù)測甘露聚糖酶的氨基酸序列相似性高達(dá)99%。預(yù)測該甘露聚糖酶基因序列是褐色高溫單孢菌YX基因組序列（CP000088.1：3642249 bp）中一段基因序列。基于巴斯德畢赤酵母密碼子使用偏好性，將其中稀有密碼子轉(zhuǎn)換為高頻表達(dá)密碼子[6]，同時(shí)對(duì)照甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列，對(duì)預(yù)測甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得優(yōu)化后甘露聚糖酶基因序列ManB已存入基因數(shù)據(jù)庫，編號(hào)為Accession No. KJ806638。在優(yōu)化的甘露聚糖酶ManB基因的3′端添加畢赤酵母偏好的終止子序列，并在5′端和3′端分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，將該基因序列交武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成全基因合成。

1.2.2 重組載體的構(gòu)建與異表達(dá) 采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切甘露聚糖酶ManB基因和酵母表達(dá)載體pPIC9K，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，以PCR驗(yàn)證法篩選出陽性克隆菌株ManB-pPIC9K-Top10。

活化菌株ManB-pPIC9K-Top10，并提取質(zhì)粒ManB-pPIC9K，采用DraⅠ線性化該載體，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞[7]。使用BMGY/BMMY誘導(dǎo)產(chǎn)酶并使用DNS法檢測酶活力，依據(jù)酶活力高低篩選陽性重組菌株ManB-GS115。

1.2.3 重組甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)檢測 使用DNS法檢測還原糖，測得甘露聚糖酶水解甘露聚糖產(chǎn)生的還原糖含量，對(duì)甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒定。每組均重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果。

1）甘露聚糖酶ManB最適溫度的測定。采用DNS法檢測甘露聚糖酶最適溫度，在pH 5.5的緩沖液下與0.5%角豆膠溶液分別在不同溫度下反應(yīng)15 min，加入 2.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加水定容至12.5 mL，于分光光度計(jì)中檢測OD540 nm。以最高酶活力為100%，計(jì)算其他條件下的相對(duì)殘余酶活力。

2）甘露聚糖酶ManB最適pH的測定。65 ℃時(shí)，甘露聚糖酶ManB在不同pH緩沖液條件下準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min，測定OD540 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露聚糖酶ManB基因序列的獲得

將ManB的基因片段連接到pPIC9K上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，獲得表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-ManB，測序結(jié)果驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 甘露聚糖酶ManB的性質(zhì)分析

結(jié)果（圖1）表明，ManB的最適反應(yīng)溫度為70 ℃。65 ℃時(shí)，甘露聚糖酶ManB在pH 4～10緩沖液條件下反應(yīng)15 min，結(jié)果（圖2）表明，在pH 9.0的條件下，相對(duì)酶活力最高。

3 小結(jié)與討論

甘露聚糖酶廣泛存在于自然界中，在造紙、飼料和食品等工業(yè)領(lǐng)域起著重要作用。通過原始菌株發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶無法滿足工業(yè)需要，因此使用工程菌表達(dá)外源蛋白成為必然。本研究優(yōu)化了ManB的酵母稀有基因密碼子為酵母高表達(dá)密碼子，主要是替換了原核生物中常見而真核生物中少見的密碼子為真核生物中常見的同一氨基酸密碼子。ManB來源于褐色高溫單孢菌的甘露聚糖酶1BQC，具有較優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，屬于糖苷水解酶類第5家族，其基因序列大小為906 bp，氨基酸序列大小為302 aa，預(yù)測其分子質(zhì)量為33.1 ku，ManB的最適溫度70 ℃，最適pH 9.0。優(yōu)化該酶基因序列后，可在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，基于其優(yōu)良性質(zhì)，可在飼料添加劑、造紙、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] SCHELLER H V，ULVSKOV P. Hemicelluloses[J].Annual Review of Plant Biology，2010，61：263-289.

[2] LUNDQVIST J，TELEMAN A，JUNEL L，et al. Isolation and characterization of galactoglucomannan from spruce（Piceaabies）[J].Carbohydrate Polymers，2002，48（1）：29-39.

[3] CHAUHAN P S，PURI N，SHARMA P，et al. Mannanases：Microbial sources，production，properties and potential biotechnological applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2012，93（5）：1817-1830.

[4] BUHERT J，SALMINEN J，SIIKA-AHO M，et al. The role of Trichodermareesei xylanase and mannanase in the treatment of softwood kraft pulp prior to bleaching[J].Holzforschung，1993，47（6）：473-478.

[5] HILGE M，GLOOR S M，RYPNIEWSKI W，et al. High-resolution native and complex structures of thermostable beta-mannanase from Thermomonosporafusca-substrate specificity in glycosyl hydrolase family 5[J].Structure，1998，6（11）：1433-1444.

[6] 趙 翔，霍克克，李育陽.畢赤酵母的密碼子用法分析[J].生物工程學(xué)報(bào)，2000，16（3）：308-311.

[7] WANG Y W，SHI P J，LUO H Y，et al. Over-expression and characterization of an alkali-tolerant endo-β-1，4-mannanase from Penicilliumfreii F63[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113（6）：710-714.